杞菊地黃湯防治MNU誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜變性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、視網(wǎng)膜變性(retinal degeneration，RD)疾病如視網(wǎng)膜色素變性(RP)、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)等因其致盲率逐年上升，已成為危害人類健康的主要致盲性眼病之一。該病發(fā)生機(jī)制不清，目前仍無肯定療效的防治策略。因此，尋找毒副作用小的中藥已成為治療此類疾病的主要努力方向。 建立良好的實(shí)驗(yàn)動物模型是研究的關(guān)鍵。N-甲基-N-亞硝脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)是廣泛分布在環(huán)境中的亞硝基化合物

2、，具有強(qiáng)致畸、致癌、致突變作用，一直用于腫瘤學(xué)方面的研究。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大鼠腹腔注射MNU可選擇性地誘導(dǎo)光感受器細(xì)胞發(fā)生凋亡。傳統(tǒng)中藥杞菊地黃湯具有滋補(bǔ)肝腎、滋腎填精、清肝明目的功效，已在眼科應(yīng)用多年，是經(jīng)典補(bǔ)益藥方。 對于視網(wǎng)膜變性疾病的研究一直以來多集中于凋亡發(fā)生的相對后期階段、針對單個或數(shù)個基因的表達(dá)，尚缺乏對于早期、整體上游分子事件的全景式探討；中藥杞菊地黃湯只有傳統(tǒng)的中醫(yī)藥理論基礎(chǔ)，缺乏可以量化的現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)理論依據(jù)，而高

3、通量基因芯片技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，為解決上述問題帶來了新的契機(jī)。本研究擬利用基因芯片技術(shù)分析差異基因表達(dá)譜，探討MNU誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜變性的早期整體分子事件及杞菊地黃湯的藥理效應(yīng)，為進(jìn)一步針對所篩察出的候選基因進(jìn)行研究提供理論基礎(chǔ)與方向。 第一部分杞菊地黃湯防治MNU誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜變性的早期形態(tài)學(xué)觀察。 目的：觀察杞菊地黃湯在MNu誘導(dǎo)的Sprague-Dawley(SD)大鼠視網(wǎng)膜變性的早期形態(tài)學(xué)改變。 方法：

4、 (1) 實(shí)驗(yàn)分組：藥物組(杞菊地黃湯灌胃+MNU皮下注射)、模型組(生理鹽水灌胃+MNU皮下注射)和正常組(生理鹽水灌胃+生理鹽水皮下注射)；藥物注射后12h，頸椎脫臼猝死大鼠。 (2) 蘇木素-伊紅(hematoxylin and erosin，H&E)染色觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)改變并測量分析視網(wǎng)膜全層及外核層厚度； (3) 透射電鏡觀察視網(wǎng)膜各層細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變； (4) 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)Dutp缺口

5、末端標(biāo)記(terminal deoxnucleotidyltransferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)法檢測細(xì)胞凋亡，計(jì)算凋亡指數(shù)。 結(jié)果： (1) 光鏡下各組大鼠視網(wǎng)膜組織學(xué)未見明顯改變，視網(wǎng)膜全層及外核層厚度組間比較均無顯著性差異(P>0.05)； (2) 電鏡下正常組和藥物組光感受器細(xì)胞大小和核染色質(zhì)分布均勻，模型組光感受器細(xì)胞開始變小，核染色質(zhì)開始濃

6、縮，外節(jié)膜盤疏松，膜型不完整； (3) TUNEL染色見模型組和藥物組外核層存在細(xì)胞凋亡，正常組未見。 結(jié)論：杞菊地黃湯通過抑制細(xì)胞凋亡等選擇性拮抗MNU對大鼠視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的早期損傷。 第二部分杞菊地黃湯對MNU誘發(fā)的大鼠視網(wǎng)膜變性基因表達(dá)譜的影響。 目的：應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究杞菊地黃湯防治MNu誘導(dǎo)的sD大鼠視網(wǎng)膜變性差異基因表達(dá)譜變化。 方法： (1) 實(shí)驗(yàn)分組：藥物組(杞菊地黃

7、湯灌胃+MNU皮下注射)、模型組(生理鹽水灌胃+MNU皮下注射)和正常組(生理鹽水灌胃+生理鹽水皮下注射)；藥物注射后12h，頸椎脫臼猝死大鼠。 (2) 抽提新鮮視網(wǎng)膜標(biāo)本的總RNA用于基因芯片(cDNA microarry)分析和實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time-polymerase chain reaction．real-timeRT-PCR)檢測。 結(jié)果： (1) 模型組/正常組和模型組/藥

8、物組中分別有75個和118個差異表達(dá)基因(比率≥2.0)，前者主要表達(dá)為上調(diào)基因，后者主要表達(dá)為下調(diào)基因。這些基因多與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、發(fā)育、免疫和防御、凋亡等生物過程有關(guān)，主要涉及到絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)信號通路和凋亡信號通路； (2) Real-time RT-PCR結(jié)果與基因芯片結(jié)果