褪黑素對雌性大鼠性發(fā)育啟動及其受體mRNA表達的影響.pdf

1、人類關于青春期啟動和調控的研究已有一個世紀之久，但其具體機制尚不明了，有關調控青春期啟動的關鍵因素至今尚不清楚。褪黑素(Melatonin，MT)是松果體分泌的吲哚類激素，具有晝低夜高的節(jié)律性。雖然已有研究證實，MT調節(jié)著季節(jié)性生殖動物的性發(fā)育和生殖，但MT是否對人類青春期啟動也發(fā)揮著關鍵的調控作用尚無定論。已知人類出生后MT水平與青春期發(fā)育進程有一定的相關性，MT水平在青春期前較高，青春期啟動時迅速下降，隨著青春期的進展逐漸減少，到性

2、成熟期維持在較低水平；特發(fā)性性早熟兒童血MT水平明顯低于同年齡組正常水平。MT對性發(fā)育啟動的影響至今仍存爭議，MT不同用藥時間及劑量的作用效果仍在探討。 MT的作用主要由其高親和力受體介導，MT受體在哺乳動物表達兩種亞型：MT1和MT2。以往實驗證實，下丘腦、垂體存在MT受體， MTX寸性發(fā)育啟動主要在下丘腦一垂體水平發(fā)揮作用，MT通過與其受體結合，阻斷促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormo

3、ne，GnRH)神經元的分泌釋放，抑制GnRt{介導的黃體生成激素(luteinizing hormone，LH)釋放。動物實驗發(fā)現(xiàn)，MT對下丘腦．垂體的作用僅出現(xiàn)在未成熟大鼠，而對性成熟大鼠無此作用，提示MT可能發(fā)揮調節(jié)性發(fā)育啟動的作用。 近年來，隨著子宮、卵巢MT受體的發(fā)現(xiàn)，MT對生殖器官的直接作用成為研究熱點。子宮肌層、子宮內膜及卵巢均存在MT受體，有學者推測MT可能與其子宮、卵巢受體結合，從而調節(jié)子宮和卵巢的功能。MT對

4、子宮、卵巢的直接作用與性發(fā)育啟動的關系，為MT對性發(fā)育啟動的作用機制提供新的理論基礎。在性發(fā)育啟動前使用MT，對其子宮、卵巢受體表達的調節(jié)作用，尚未見文獻報道。 MT可能對骨的生長發(fā)育發(fā)揮著重要的作用。MT峰值與骨齡相關，在性發(fā)育啟動前MT對股骨長度增長的影響，尚未見相關報道。MT對骨形成的促進或抑制作用可能與年齡有一定關系，MT在不同年齡階段對骨發(fā)揮著不同的作用，可能影響長骨長度的增長，這為臨床治療性發(fā)育異常疾病提供新的思路。

5、 實驗室培養(yǎng)大鼠，下丘腦一垂體一性腺軸的發(fā)育與人類有相近之處，與人類一樣是非季節(jié)性生殖動物，故已成為研究性發(fā)育的重要實驗動物之一。大鼠MI的分泌也呈晝低夜高節(jié)律性，對大鼠的生理功能發(fā)揮重要作用。本實驗中采用實驗室培育雌性SD大鼠作為研究對象，按照文獻統(tǒng)一采用的標準，將陰道口開放時間及首次動情間期出現(xiàn)時間作為判斷大鼠性發(fā)育啟動的外在標志。性發(fā)育啟動過程中，大鼠子宮、卵巢的發(fā)育及血LH水平，可以作為反映大鼠性發(fā)育啟動的內在指標。本實驗采用子

6、宮指數(shù)、卵巢指數(shù)、子宮內膜厚度指數(shù)、子宮肌層厚度指數(shù)，反映子宮和卵巢生長發(fā)育情況，用卵巢黃體數(shù)反映卵巢的排卵情況。 研究目的： 1.不同劑量、給藥時間下的MT對雌性SD大鼠性發(fā)育啟動的影響； 2.雌性SD大鼠性發(fā)育啟動前使用MT，對其子宮、卵巢MT受體mRNA表達的影響，探討MT在子宮、卵巢可能發(fā)揮的直接作用及其機制； 3.未成熟雌性SD大鼠短期使用MT至性發(fā)育啟動對其股骨長度生長的影響。 研究內

7、容及方法： 動物分組及處理光照12小時/黑暗12小時條件下飼養(yǎng)的21日齡SD大鼠70只，隨機分為4組。MT高劑量組：分為白天組(10只，下午4點給藥)及夜晚組(10只，午夜2點給藥)，皮下注射MT 50mg/kg/日；MT低劑量組：分為白天組(10只，下午4點給藥)及夜晚組(10只，午夜2點給藥)，皮下注射MT 20mg/kg/日；生理鹽水對照組：分為白天組(10只，下午4點給藥)及夜晚組(10只，午夜2點給藥)，皮下注射等體積

8、生理鹽水；自然對照組(10只)：不予處理自然飼養(yǎng)。各組均飼養(yǎng)至大鼠出現(xiàn)首次動情間期的當日處死。 觀察指標及研究方法觀察大鼠陰道口開放情況，于陰道口開放后行陰道細胞涂片，記錄大鼠陰道口開放及首次動情間期出現(xiàn)時的日齡。于出現(xiàn)首次動情問期的當日上午9時處死大鼠，取血，采用酶聯(lián)免疫吸附測試法測定血清LH水平；取股骨，測定其長度；取子宮、卵巢，稱取濕重量，計算子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)；H-E染色光鏡下觀察，測量子宮內膜厚度指數(shù)和肌層厚度指數(shù)，計

9、數(shù)卵巢黃體數(shù)；RT-PCR方法測定子宮、卵巢MT兩種受體MT1和MT2 mRSA表達量。 統(tǒng)計學處理用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，結果用均數(shù)士標準差表示，利用方差分析及獨立樣本T-檢驗方法進行分析，P<0.05認為差異有顯著性。 結果： 1.MT組與生理鹽水對照組的比較 (1)性發(fā)育啟動時間的比較各組大鼠陰道口開放時間的比較顯示，MT高、低劑量組比生理鹽水對照組時間延長(P<0.05)，夜晚用藥

10、組比白天用藥組時間延長(P<0.05)，高、低劑量組間無顯著性差異(P>0.05)。 各組大鼠首次動情間期出現(xiàn)時間的比較顯示，MT高、低劑量組比生理鹽水對照組時間延長(P<0.05)，夜晚用藥組比白天用藥組時間延長(P<0.05)，高、低劑量組間無顯著性差異(P>0.05)。 (2)生殖器官發(fā)育水平的比較各組大鼠的子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)、子宮內膜厚度指數(shù)、子宮肌層厚度指數(shù)的比較顯示，使用MT的大鼠組四項觀測指標變化趨勢一致，

11、MT高、低劑量組比生理鹽水對照組四項觀測指標的水平低，高劑量組比低劑量組水平低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，夜晚與白天用藥組間無顯著性差異(P>0.05)。 各組大鼠卵巢黃體數(shù)的比較，MT高、低劑量組黃體數(shù)比生理鹽水對照組少(P<0.05)，但高、低劑量組間、夜晚與白天用藥組問無顯著性差異(P>0.05)。 (3)生殖器官的MT1、MT2受體mRNA表達水平的比較各組大鼠子宮的MT1、MT2 mRNA表達水平與卵巢

12、的兩種MTmRNA受體表達變化趨勢一致。 在各組的子宮、卵巢標本，高、低劑量組的MT1、MT2 mRNA表達水平高于生理鹽水對照組，夜晚用藥組的MT1、MT2 mRNA表達水平均比白天組高(P<0.05)，MT1 mRNA表達水平高低劑量組間無顯著性差異(P>0.05)，而MT2 mRNA在高劑量組表達水平高于低劑量組，同一組內MT1 mRNA表達水平始終高于MT2 mRNA(P<0.05)。 (4)血清LH水平的比較M

13、T高劑量組、低劑量組的血清LH水平比生理鹽水對照組低，高劑量組的LH水平較低劑量組低，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MT夜晚用藥組比白天用藥組的LH水平低，差異有顯著性(P<0.05)。 (5)股骨長度的比較MT高劑量組、低劑量組股骨長度比生理鹽水對照組稍短，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但高、低劑量組間，夜晚用藥組與白天用藥組間，結果無顯著性差異(P>0.05)。 2.生理鹽水對照組與自然對照組的比較