CC族趨化因子21的克隆、表達(dá)及其誘導(dǎo)抗瘤效應(yīng)研究.pdf

1、機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視與抗腫瘤免疫應(yīng)答在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中起重要作用。然而腫瘤通過多種機(jī)制逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，如腫瘤細(xì)胞抗原性弱，缺乏激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的必需成分；腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié)分子，形成負(fù)性調(diào)節(jié)微環(huán)境，抑制相關(guān)抗瘤免疫應(yīng)答；腫瘤細(xì)胞通過產(chǎn)生FasL誘導(dǎo)腫瘤特異性T細(xì)胞死亡，以及腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)免疫耐受等。如何增強(qiáng)腫瘤的抗原性，促進(jìn)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答是腫瘤免疫治療研究中急需解決的關(guān)鍵問題。CC族趨化因子21(CCL21)

2、是CC族趨化因子，高表達(dá)于人次級淋巴組織高內(nèi)皮小靜脈和淋巴結(jié)的T細(xì)胞區(qū)。其受體CCR7表達(dá)于初始T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞。目前研究證明淋巴結(jié)部位CCL21與其相應(yīng)受體CCR7的結(jié)合，可促進(jìn)細(xì)胞向淋巴結(jié)等次級淋巴組織移動，與淋巴細(xì)胞歸巢以及腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，CCL21與CCR7相互作用，雖可促進(jìn)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答，但又可引起腫瘤細(xì)胞向高表達(dá)SLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。我們前期研究表明轉(zhuǎn)染CCL21

3、顯著抑制腫瘤生長，且在腫瘤局部發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞水平明顯升高。
　　 目的：基于上述理論，本課題設(shè)計(jì)采用基因工程技術(shù)，構(gòu)建CCL21真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞表達(dá)CCL21，通過旁分泌與自分泌，作用于表達(dá)CCR7的腫瘤細(xì)胞及免疫細(xì)胞，觀察腫瘤源性CCL21增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫原性，探討CCL21誘導(dǎo)的抗瘤效應(yīng)及其機(jī)制。
　　 一、人CCL21真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)
　　 1．人CCL21基因克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建

4、
　　 以正常人脾臟cDNA為模板，RT-PCR技術(shù)獲取編碼CCL21 cDNA，通過去除終止密碼子，加入Kozak序列，引入EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)，將其克隆入紅色熒光蛋白真核表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒pDsRed2-N1-CCL21，經(jīng)酶切鑒定及測序分析證實(shí)，所克隆和構(gòu)建的CCL21 cDNA閱讀框及連接部位序列正確；
　　 2．CCL21真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MCF-7及其表達(dá)
　　 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞

5、MCF-7，12小時后通過倒置熒光顯微鏡觀察可見細(xì)胞胞內(nèi)紅色熒光表達(dá)；收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清，熒光分光光度計(jì)及western blot檢測結(jié)果表明，CCL21-RFP以分泌型形式表達(dá)，并在轉(zhuǎn)染后72小時達(dá)到高峰；
　　 3．穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
　　 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7，利用G418篩選，有限稀釋克隆化，獲得抗性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，通過熒光顯微鏡觀察，證實(shí)95[％]以上的細(xì)胞表達(dá)紅色熒光，通過westernblot證實(shí)，CC

6、L21持續(xù)分泌至上清，命名為MCF-7-CCL21。
　　 二、轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7增強(qiáng)MCF-7免疫原性及其機(jī)制
　　 1．分組
　　 1)未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MCF-7對照組：MCF-7
　　 2)轉(zhuǎn)染空載體pDsRed2-N1的MCF-7對照組：MCF-7-vector
　　 3)轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7實(shí)驗(yàn)組：MCF-7-CCL21
　　 4)MCF-7-vector與MCF-7混

7、合培養(yǎng)組：MCF-7-vector與MCF-7以1:10比例混合
　　 5)MCF-7-CCL21與 MCF-7混合培養(yǎng)組：MCF-7-CCL21與MCF-7以1:10比例混合
　　 2．方法：
　　 1)間接免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞表面HLA-I類分子表達(dá)；Western blot觀察腫瘤細(xì)胞中抗原轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAP-1)表達(dá)；
　　 2)實(shí)時定量PCR檢測腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)FasL mRNA水平；ELI

8、SA檢測培養(yǎng)上清中生長轉(zhuǎn)化因子TGF-β含量；
　　 3)流式細(xì)胞術(shù)檢測絲裂霉素C誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；
　　 4) PI染色觀察凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)的外周血單個核細(xì)胞增殖。
　　 3．結(jié)果：
　　 1)與未轉(zhuǎn)染以及轉(zhuǎn)染空載體的對照組比較，轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7表面HLA-I類分子和胞內(nèi)TAP-1蛋白表達(dá)增高，激發(fā)PBMC增殖；MCF-7-CCL21胞內(nèi)FasL合成減少，培養(yǎng)上清中TGF-β含量明顯降低，結(jié)果提示

9、轉(zhuǎn)染CCL21可增強(qiáng)其免疫原性；
　　 2)轉(zhuǎn)染CCL21可促進(jìn)絲裂霉素C誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)的PBMC殺瘤作用增強(qiáng)，表明MCF-7表達(dá)的CCL21不僅可促進(jìn)絲裂霉素C誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時可能提供危險(xiǎn)信號，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，有效誘導(dǎo)PBMC殺瘤效應(yīng)；
　　 3)轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7與MCF-7混合培養(yǎng)組與空載體轉(zhuǎn)染混合培養(yǎng)組比較，通過上述指標(biāo)檢測結(jié)果表明，腫瘤源性CCL21不僅可促進(jìn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫

10、原性，同時可增強(qiáng)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫原性。
　　 三、CCL21轉(zhuǎn)染MCF-7對樹突狀細(xì)胞抗原提呈及其凋亡的影響
　　 1．分組
　　 1)空白對照組：樹突狀細(xì)胞以生理鹽水刺激
　　 2)MCF-7刺激組：未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MCF-7刺激樹突狀細(xì)胞
　　 3)MCF-7-vector：轉(zhuǎn)染空載體的MCF-7刺激樹突狀細(xì)胞
　　 4)MCF-7-CCL21：轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7刺激樹突狀細(xì)胞

11、r>　　 2．方法：
　　 1)DC制備：應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞，培養(yǎng)8 h后吸取懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞加入GM-CSF與IL-4，培養(yǎng)5天
　　 2)DC刺激：MCF-7、轉(zhuǎn)染空載體的MCF-7及轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7經(jīng)過絲裂霉素C處理后作為刺激細(xì)胞，分別與DC以1：1比例混合培養(yǎng)48h
　　 3)應(yīng)用多重濃度淋巴細(xì)胞分離液分離DC
　　 ①趨化實(shí)驗(yàn)觀察各組DC的遷移能力
　　

12、 ②流式細(xì)胞術(shù)檢測DC吞噬FITC標(biāo)記葡聚糖
　　 ③實(shí)時定量PCR檢測DC的CD80,CD86 mRNA的表達(dá)
　　 ④Western blot檢測DC細(xì)胞胞內(nèi)TAP-1的表達(dá)
　　 ⑤應(yīng)用ANNEXIN-V抗體流式細(xì)胞術(shù)檢測DC凋亡
　　 ⑥Western blot檢測 DC內(nèi)Caspase-3,bcl-2表達(dá)
　　 ⑦螢火蟲熒光素酶標(biāo)記的NF-kB啟動子化學(xué)發(fā)光發(fā)檢測NF-kB活性
　

13、　 4)上述致敏DC與自體淋巴細(xì)胞以1:5比例混合培養(yǎng)，7天后收集淋巴細(xì)胞。將此淋巴細(xì)胞與CFSE標(biāo)記的MCF-7以1:50比例混合培養(yǎng)，作用24h
　　 ①PI染色，F(xiàn)CM測定致敏淋巴細(xì)胞對CFSE標(biāo)記的MCF-7胞毒效應(yīng)
　　 ②FCM檢測表達(dá)穿孔素的CD8+T細(xì)胞與不表達(dá)穿孔素的CD8+T細(xì)胞比例
　　 ③取培養(yǎng)上清，ELISA檢測IFN-γ、TNF-α、IL-10
　　 3．結(jié)果：
　　

14、 1)與未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染空載體的對照組比較，轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7刺激的DC遷移與吞噬能力均明顯增強(qiáng)，胞內(nèi)TAP-1表達(dá)升高，以及CD80,CD86 mRNA表達(dá)升高，以上結(jié)果提示轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7刺激的DC抗原提呈能力增強(qiáng)；
　　 2)轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7刺激的DC凋亡率與Caspase-3表達(dá)降低，bcl-2表達(dá)升高；
　　 3)轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7刺激的DC其NF-κB活性增高；
　　

15、4)轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7刺激的DC誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞中表達(dá)穿孔素CD8+T細(xì)胞增多，對MCF-7胞毒效應(yīng)明顯增強(qiáng)，IFN-γ，TNF-α的分泌增加，而IL-10的分泌減少，提示轉(zhuǎn)染CCL21的MCF-7刺激的DC可有效激活抗腫瘤特異性T細(xì)胞，增強(qiáng)抗瘤效應(yīng)。
　　 結(jié)論：通過轉(zhuǎn)染CCL21至腫瘤細(xì)胞，可提高腫瘤細(xì)胞免疫原性，增強(qiáng)絲裂霉素C誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，腫瘤源性CCL21促進(jìn)樹突狀細(xì)胞抗原提呈，有效誘導(dǎo)抗腫瘤特異性T細(xì)胞的殺