植物疫害生物分子檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究與固相化檢測(cè)試劑盒研制.pdf

1、本博士論文針對(duì)國(guó)內(nèi)外植物疫害生物急需相應(yīng)檢疫檢驗(yàn)技術(shù)體系和快速檢測(cè)試劑（盒）的現(xiàn)狀，選擇嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全的柑桔潰瘍病菌、亞洲柑桔韌皮部桿菌、小麥矮腥黑穗菌和馬鈴薯種傳病毒等為靶標(biāo)疫害微生物，依據(jù)專有基因序列設(shè)計(jì)特異性引物/探針，利用簡(jiǎn)易快速、高效排抑的膜分離樣品制備方法，建立了靶標(biāo)疫害微生物特異、準(zhǔn)確的免疫診斷和PCR檢驗(yàn)檢疫技術(shù)體系，并基于獨(dú)創(chuàng)的生物大分子穩(wěn)定劑創(chuàng)制新型固相化分子診斷試劑盒，并用于近緣種類的甄別、田間病害早期診斷和

2、疫情動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。對(duì)于增強(qiáng)我國(guó)防范農(nóng)業(yè)植物外來疫害入侵和擴(kuò)散的檢疫監(jiān)控能力，提高我國(guó)農(nóng)業(yè)植物疫害生物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)整體水平，確保中國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的安全生產(chǎn)，促進(jìn)中國(guó)農(nóng)產(chǎn)品順利出口具有重要意義。 (1) 柑桔潰瘍病菌（Xanthomonas axonopodis pv. Citri, Xac）引起的柑桔潰瘍病是嚴(yán)重影響全世界柑桔生產(chǎn)的重大檢疫性病害。本研究選擇Xac獨(dú)有蛋白基因序列分別設(shè)計(jì)篩選出特異性引物對(duì)(JYF5/JYR5)，建立了柑桔潰

3、瘍病菌常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)，經(jīng)反復(fù)測(cè)試結(jié)果表明能夠穩(wěn)定地特異性檢出柑桔組織表面所帶潰瘍病菌的DNA靶帶(413 bp)。而對(duì)柑桔葉面附生的非致病性黃單胞菌、野油菜黃單胞菌等近緣種以及健康柑桔樣品都不能擴(kuò)增出該靶帶；靶細(xì)菌DNA檢測(cè)下限為1.56 pg/μL，細(xì)菌懸浮液檢測(cè)下限為10 cfu/μL；在不同PCR儀及各種控溫方式下都能穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出特征性靶帶，說明該檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成熟穩(wěn)定。以插入Xac靶序列片段的重組質(zhì)粒DNA或潰瘍病菌菌液或顯癥

4、材料作為陽性對(duì)照樣品，以盆栽柑桔實(shí)生苗作為陰性對(duì)照樣品，利用建立的PCR技術(shù)和固相化檢測(cè)試劑盒對(duì)南方柑桔主產(chǎn)區(qū)的柑桔葉片、枝條和果實(shí)樣品統(tǒng)一制樣進(jìn)行了實(shí)際檢測(cè)，結(jié)果與各地實(shí)際病害發(fā)生一致。 (2) 柑桔黃龍?。–itrus Huanglongbing, HLB）由難以人工培養(yǎng)的韌皮部桿狀細(xì)菌所引起，是嚴(yán)重影響世界柑桔產(chǎn)業(yè)的重要檢疫性細(xì)菌病害之一。該病可以通過罹病接穗嫁接、帶菌柑桔木虱（Diaphorina citri）取食健株新

5、梢以及罹病柑桔種苗遠(yuǎn)距離傳播。利用克隆測(cè)序的16S rDNA核糖體蛋白基因序列片段比對(duì)分析，設(shè)計(jì)靶序列特異引物對(duì)和熒光探針，建立并優(yōu)化了柑桔黃龍病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus）的常規(guī)PCR、熒光染料和TaqMan探針定量PCR反應(yīng)體系，分別測(cè)評(píng)了檢測(cè)特異性、靈敏度以及準(zhǔn)確度，結(jié)果表明TaqMan探針PCR對(duì)于靶標(biāo)病原菌的檢測(cè)特異性最強(qiáng)，但檢測(cè)成本較高；SYBR Green I 染料法的檢測(cè)靈敏度

6、最高，常規(guī)PCR、TaqMan探針法、SYBR Green I 染料法對(duì)靶片段序列DNA的檢測(cè)下限依次為43.90 fg/μl、4.39 fg/μl、0.44 fg/μl，定量PCR檢測(cè)靈敏度較常規(guī)PCR高出至少1－2個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)來自6省市果園送檢的顯癥或無癥柑桔組織樣品進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)，結(jié)果表明基于特異引物對(duì)的常規(guī)PCR和TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，都可以快速準(zhǔn)確地檢出疫害生物的靶標(biāo)序列片段，TaqMan探針法檢出率更高。

7、 (3) 小麥矮腥黑穗病菌（Tilletia controversa Kühn, TCK）引起的小麥矮腥黑穗?。╓heat dwarf bunt disease），是麥類腥黑穗病中危害最大、極難防治的國(guó)內(nèi)外檢疫性病害之一。TCK與其近緣種小麥網(wǎng)腥黑穗病菌(Tilletia caries Tul，TCT）在冬孢子形態(tài)學(xué)、ITS基因水平上都具有很高的同源性，國(guó)內(nèi)外利用18S rDNA的轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列分析、隨機(jī)多態(tài)性DAN 擴(kuò)增、Rep-PC

8、R、基因指紋圖譜等方法尋找TCK種內(nèi)及種間差異的努力，一直未能成功。 本博士論文采用RAPD引物介導(dǎo)的半特異性PCR法（RAPD primer mediated semi-specific PCR, RM-PCR）篩選TCK的端粒相關(guān)序列。根據(jù)端粒DNA（Telomere sequence）保守重復(fù)序列TTAGGG和端粒相關(guān)序列（Telomere associated-sequence, TAS）的高度多態(tài)性特點(diǎn)，將帶有錨定堿基

9、的端粒特異性引物（5’CCCTAACCCTAACCCWAA 3’）和RAPD隨機(jī)引物結(jié)合，擴(kuò)增端粒相關(guān)序列（TAS）。采用不對(duì)稱復(fù)性溫度PCR方法，高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)和低嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)交替進(jìn)行，使端粒重復(fù)序列特異引物擴(kuò)增的特異性產(chǎn)物產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過RAPD單引物擴(kuò)增的非特異性產(chǎn)物。通過變換隨機(jī)單引物，篩選出TCK與TCT不同的端粒相關(guān)序列，并將篩選的4個(gè)特異性端粒相關(guān)序列克隆測(cè)序，經(jīng)與國(guó)際上三大基因文庫BLASTn聯(lián)網(wǎng)比對(duì)分析序列同源性，選出與其他已知真

10、菌的同源性都很低的TCK特征性差異序列片段（1322bp），并據(jù)此設(shè)計(jì)兩對(duì)特異引物CQUTCK1/CQUTCK2和CQUTCK3/CQUTCK4，分別以制備的TCK和TCT的冬孢子或菌絲體DNA為模板，采用降落PCR（Touch down PCR, TD-PCR）擴(kuò)增驗(yàn)證了引物特異性，結(jié)果表明，在供試TCK所有菌株中，兩對(duì)引物均能擴(kuò)增出預(yù)期的目標(biāo)DNA譜帶，而TCT菌株中則無相同的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，證實(shí)靶標(biāo)片段確為TCK的特異基因序列片段

11、，引物對(duì)具有很高的特異性，可用于TCK和TCT分子水平的快速鑒定。本研究成果解決了?；訲CK分子檢疫檢驗(yàn)技術(shù)體系的建立和檢測(cè)試劑盒的研制中的關(guān)鍵技術(shù)難題。已獲準(zhǔn)登陸NCBI基因文庫（GenBank，Accession No: DQ266258）。 (4) 引致馬鈴薯品種退化、產(chǎn)量下降的PLRV、PVX、PVY、PVA、PVS以及PSTVd等多種病毒是我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的主要有害生物，工廠化組培馬鈴薯種苗和各級(jí)種薯品質(zhì)的檢定和田間復(fù)

12、合侵染馬鈴薯病害的種類鑒定都需要快速準(zhǔn)確的分子檢驗(yàn)技術(shù)。利用篩選的Triton X-100和Na2SO3 病毒釋放劑，直接從組織中提取馬鈴薯ssRNA病毒的簡(jiǎn)易浸提法，優(yōu)化反轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)病毒下游引物比例、PCR擴(kuò)增的復(fù)性溫度、Mg2＋和dNTPs濃度的基礎(chǔ)上，建立了比一步法靈敏度更高而且穩(wěn)定的兩步法多重RT-PCR檢測(cè)體系，該檢測(cè)體系同DSA－ELISA相比靈敏度高約100倍。研制了兩步法多重RT-PCR固相化檢測(cè)試劑盒。采用多重RT-PC

13、R檢測(cè)試劑盒對(duì)來自四川、重慶等15縣市248個(gè)苗圃與大田的顯癥或無癥馬鈴薯種薯（苗）樣品實(shí)際檢測(cè)，都能正確檢測(cè)出植株所帶病毒。為馬鈴薯病毒病快速鑒定和田間病害早期診斷提供了分子檢測(cè)技術(shù)和實(shí)用工具，適合于省級(jí)植保部門和脫毒種薯育苗單位以及科研部門推廣使用。 (5) 病害分子檢測(cè)中，陽性對(duì)照的缺乏和不準(zhǔn)確是影響檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化和準(zhǔn)確性的重要因素。同時(shí)使用活體微生物作為陽性對(duì)照還存在有害生物擴(kuò)散的危險(xiǎn)，加熱滅活的菌液因保存期限短，不宜作為陽

14、性對(duì)照。本研究將以特異性引物擴(kuò)增的DNA片段克隆測(cè)序，確認(rèn)特異性后經(jīng)克隆轉(zhuǎn)化，建立了疫害生物的重組質(zhì)粒DNA陽性參照品，為病害檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化提供了技術(shù)支撐，確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可比性，避免了檢測(cè)過程中檢疫性有害生物在環(huán)境中的二次擴(kuò)散。 (6) 基于上述靶標(biāo)疫害生物的特異性引物/探針，優(yōu)化的相應(yīng)分子檢測(cè)方法、反應(yīng)條件和試劑配方，加入專有的生物活性分子穩(wěn)定劑經(jīng)過預(yù)混分裝，預(yù)凍后經(jīng)真空冷凍干燥后制成固相化檢測(cè)試劑盒。經(jīng)反復(fù)測(cè)試表明固相化試劑

15、盒可以在常溫條件下密封保存至少半年,檢測(cè)穩(wěn)定性、靈敏度和特異性等各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均無明顯改變。試劑盒即開即用，操作簡(jiǎn)單，利于檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化，適用于大量樣品的檢測(cè)。目前已研制出的系列固相化試劑盒包括柑桔潰瘍病菌、柑桔黃龍病菌小麥矮腥黒穗菌的PCR固相化檢測(cè)試劑盒；SGI熒光染料和TaqMan水解探針定量PCR固相化檢測(cè)試劑盒；馬鈴薯病毒多重－RT－PCR檢測(cè)試劑盒。已經(jīng)用于國(guó)內(nèi)外相關(guān)疫害生物各種送檢或采集樣品的實(shí)際檢驗(yàn)檢疫。已申報(bào)4項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)與固