水通道蛋白3在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)及在玻璃化凍融過程中的作用.pdf

1、研究背景：
　　水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一類介導(dǎo)高效水轉(zhuǎn)運(yùn)的膜蛋白，廣泛分布于機(jī)體組織細(xì)胞的胞膜上，介導(dǎo)各種類型細(xì)胞膜的水轉(zhuǎn)運(yùn),在維持細(xì)胞的滲透壓平衡中發(fā)揮重要的作用。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物水通道家族已有13個(gè)成員(AQP0-AQP12)，根據(jù)其功能主要分為專一性水通道蛋白及甘油水通道蛋白兩大類。甘油水通道蛋白比較特殊，它們不僅可以介導(dǎo)自由水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，還可介導(dǎo)一些線性小分子物質(zhì)如甘油、尿素、羥基化合物等

2、的轉(zhuǎn)運(yùn)，包括AQP3，7，8，9和AQP10。近十年來，AQPs的結(jié)構(gòu)及功能被各學(xué)科所關(guān)注。有文獻(xiàn)報(bào)道，有11種水通道蛋白（AQP0-AQP10）豐富地表達(dá)于哺乳動(dòng)物的睪丸、精子、卵泡、子宮、胚胎、胎盤、胎膜等組織，參與精子發(fā)生、卵泡發(fā)育成熟、囊胚形成、胚胎著床、母胎液體平衡等生殖過程。AQPs表達(dá)于小鼠早期胚胎已多次得到證實(shí)，其中，AQP3 mRNA、AQP7mRNA高表達(dá)于早期胚胎各發(fā)育時(shí)期、AQP8 mRNA高表達(dá)于早期囊胚是多項(xiàng)

3、研究結(jié)果的一致之處，且各時(shí)期胚胎AQPs的表達(dá)情況可隨環(huán)境的改變而發(fā)生變化。
　　自1983年Trounson等取得凍融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)-ET）的臨床妊娠以來，F(xiàn)-ET已經(jīng)成為人類輔助生殖技術(shù)（Assisted Reproductive Technology，ART）的重要組成部分，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界應(yīng)用ART的出生兒中，有25％來自F-ET周期；在ART所有的移植胚胎中，約42

4、%來自凍融胚胎。因此，胚胎凍融技術(shù)在 ART中占有重要地位，且隨著近年來大力提倡單胚胎移植，如何進(jìn)一步完善胚胎凍融的方法，保障凍融胚胎的復(fù)蘇率及質(zhì)量也成為學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)。
　　有研究指出，細(xì)胞的膜滲透性是決定其能否耐受冷凍過程的關(guān)鍵因素，凍融成功的關(guān)鍵在于水和高濃度低溫防護(hù)劑在細(xì)胞內(nèi)外的快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、分布并達(dá)到滲透壓平衡。還有研究表明，早期胚胎在高滲溶液中起應(yīng)激反應(yīng)的主要效應(yīng)之一是AQPs的表達(dá)及蛋白定位的變化，且目前除了AQP

5、s外尚未發(fā)現(xiàn)其他可介導(dǎo)水分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)。那么，AQPs在早期胚胎中的表達(dá)特性如何？其如何參與早期胚胎的發(fā)育過程？在哺乳動(dòng)物早期胚胎的凍融過程中，AQPs特別是甘油水通道蛋白亞族是否就是水和低溫防護(hù)劑跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)分布的主要分子途徑？如果是，其作用機(jī)制如何？這些問題至今并未得以完全闡明。
　　本研究選取在早期胚胎各階段均有高表達(dá)且可能在高滲冷凍防護(hù)劑環(huán)境中發(fā)揮作用的AQP3，研究其在小鼠早期胚胎各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)規(guī)律與分布特征，并通過對(duì)

6、比胚胎玻璃化冷凍-解凍前后AQP3表達(dá)情況的變化，探討AQP3在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中的作用及在胚胎凍融過程中的可能調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究對(duì)完善生殖生理學(xué)中早期胚胎發(fā)育的機(jī)制、闡明胚胎凍融過程中膜調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要意義，也是發(fā)展胚胎凍融改進(jìn)方法的重要切入點(diǎn)。
　　研究?jī)?nèi)容：
　　第一部分：AQP3在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)及作用
　　目的：
　　檢測(cè)小鼠早期胚胎各發(fā)育時(shí)期AQP3的表達(dá)及分布情況，探討AQP3在小鼠早

7、期胚胎發(fā)育過程中的作用及機(jī)制。
　　材料與方法：
　　對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠予孕馬血清促性腺激素（PMSG）聯(lián)合絨毛膜促性腺激素（HCG）制備控制性超促排卵（COH）模型，使其交配受孕；手術(shù)法收集不同發(fā)育時(shí)期的早期胚胎：四細(xì)胞期（HCG注射后60小時(shí)）、八細(xì)胞期（HCG注射后65-68小時(shí)）、桑葚胚期（HCG注射后72-80小時(shí)）、早期囊胚（82-90小時(shí)）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測(cè)四個(gè)時(shí)期的胚胎AQP3 mRNA的相

8、對(duì)表達(dá)量，采用2-△CT法計(jì)算各時(shí)期胚胎AQP3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量并進(jìn)行比較，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；免疫熒光顯微鏡對(duì)收集到的各時(shí)期胚胎進(jìn)行AQP3表達(dá)的定性檢測(cè)；激光共聚焦顯微鏡對(duì)各時(shí)期胚胎進(jìn)行AQP3蛋白亞細(xì)胞定位分析。
　　結(jié)果：
　　1.qRT-PCR結(jié)果顯示，小鼠四細(xì)胞期、八細(xì)胞期、桑葚期胚胎及早期囊胚均有AQP3 mRNA表達(dá)，其中桑葚胚期最高，囊胚期的表達(dá)

9、最低，但各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）
　　2.免疫熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，小鼠四細(xì)胞期、八細(xì)胞期、桑葚期胚胎及早期囊胚均可檢測(cè)到特異性AQP3的陽(yáng)性信號(hào)，陰性對(duì)照未檢測(cè)到熒光信號(hào)。
　　3.激光共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四細(xì)胞期及八細(xì)胞期胚胎的特異性 AQP3熒光信號(hào)均分布在卵裂球的胞質(zhì)、核膜處，其中均以核膜處的熒光信號(hào)較強(qiáng)；桑葚胚的AQP3熒光信號(hào)主要分布在各卵裂球的胞膜及各卵裂球連接處；早期囊胚則主要分布滋養(yǎng)

10、層細(xì)胞的胞質(zhì)及胞膜中，囊胚腔中也可見熒光信號(hào)。
　　結(jié)論：
　　1.AQP3 mRNA表達(dá)于小鼠早期胚胎各發(fā)育時(shí)期，提示AQP3 mRNA可能參與胚胎基因組的組成，對(duì)小鼠早期胚胎的發(fā)育起潛在的調(diào)控作用。
　　2.AQP3的蛋白亞細(xì)胞定位在各發(fā)育時(shí)期不完全相同，說明其可隨各時(shí)期胚胎的發(fā)育需要而發(fā)生表達(dá)和功能上相應(yīng)調(diào)節(jié)。
　　第二部分：水通道蛋白3在小鼠胚胎玻璃化冷凍前后的表達(dá)及分布變化
　　目的：
　　

11、比較AQP3在小鼠八細(xì)胞期胚胎、桑葚胚及早期囊胚玻璃化凍融前后的表達(dá)及分布情況，以探討AQP3在小鼠早期胚胎凍融過程中的可能作用及調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　材料與方法：
　　制備小鼠 COH模型，顯微鏡下手術(shù)法收集小鼠八細(xì)胞期、桑葚期胚胎及早期囊胚（方法同第一部分）。應(yīng)用免疫熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)、蛋白印記法（Western Blot）檢測(cè)以上三個(gè)時(shí)期新鮮胚胎AQP3的表達(dá)、分布情況及蛋白相對(duì)表達(dá)量；對(duì)這三個(gè)時(shí)期的胚胎進(jìn)行玻

12、璃化冷凍-解凍，應(yīng)用免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)及Western Blot對(duì)凍融后三個(gè)時(shí)期的胚胎AQP3的表達(dá)、分布情況及蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，并與同時(shí)期新鮮胚胎進(jìn)行對(duì)比分析。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。Western Blot以GAPDH條帶為內(nèi)參進(jìn)行蛋白上樣量校正，條帶采用Image Plus6.0專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行分析，取平均值進(jìn)行計(jì)算，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：

13、>　　1.免疫熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，在冷凍前、凍融后的各時(shí)期胚胎均可檢測(cè)到明顯的特異性AQP3的陽(yáng)性、信號(hào)，陰性對(duì)照未檢測(cè)到熒光信號(hào)。
　　2.激光共聚焦掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新鮮胚胎：八細(xì)胞期胚胎的綠色熒光均質(zhì)分布在卵裂球的核膜、胞質(zhì)處，其中核膜處熒光信號(hào)較強(qiáng)；桑葚胚的綠色熒光較均質(zhì)分布在各卵裂球的胞膜；早期囊胚主要分布在滋養(yǎng)層細(xì)胞的胞質(zhì)、胞膜中，囊胚腔內(nèi)也可見熒光信號(hào)。凍融復(fù)蘇后胚胎：八細(xì)胞期胚胎的綠色熒光呈明顯小顆粒狀分布于卵裂球

14、的胞膜、胞質(zhì)，少數(shù)分布于核膜處；桑葚胚主要分布于胞膜；早期囊胚主要分布于滋養(yǎng)層細(xì)胞的胞膜、胞質(zhì)中。
　　3.Western Blot檢測(cè)到各組胚胎凍融前后均有AQP3表達(dá)，以校正值K（AQP3條帶IOD/GAPDH條帶IOD）進(jìn)行半定量分析，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：胚胎冷凍前，八細(xì)胞期AQP3相對(duì)表達(dá)量最高，其次為早期囊胚，桑葚胚期最低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；胚胎凍融后，桑葚胚期 AQP3相對(duì)表達(dá)量最高，其次為八細(xì)胞期，

15、早期囊胚期最低，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。八細(xì)胞期及早期囊胚凍融后AQP3相對(duì)表達(dá)量均顯著低于冷凍前（P<0.05），而桑葚胚期則高于冷凍前（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.AQP3在KM小鼠新鮮胚胎的蛋白亞細(xì)胞定可位隨各發(fā)育時(shí)期的不同而顯示不同的表達(dá)模式，而經(jīng)過玻璃化冷凍-解凍，各時(shí)期復(fù)蘇胚胎的AQP3蛋白定位都主要位于胞膜上，提示 AQP3可能在小鼠早期胚胎各時(shí)期的凍融過程中均主要介導(dǎo)胚胎與外界的液體