A20基因?qū)-,2-O-,2-誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖及分子機(jī)制探討和中藥大黃素干預(yù)研究.pdf

1、目的：血管平滑肌細(xì)胞增殖是動脈粥樣硬化（AS）及經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）術(shù)后再狹窄（RS）的重要原因，對增殖機(jī)制以及抑制其增殖的研究近年來一直是心血管領(lǐng)域的熱點。過氧化氫（H2O2）是一種體內(nèi)氧自由基，屬于活性氧家族成員之一。新近的離體研究發(fā)現(xiàn)H2O2可以通過細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑來影響細(xì)胞的增殖，分化和多種基因的轉(zhuǎn)錄。核因子（NF-κB）是對活性氧敏感的轉(zhuǎn)錄因子，對于促炎因子的表達(dá)起重要的作用?；钚匝跬ㄟ^氧化調(diào)節(jié)NF-κB使其活化，

2、活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)涉及炎癥，增殖的多個基因的轉(zhuǎn)錄。已有實驗證明以H2O2為主要代表的活性氧通過轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號通路激活誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的增殖從而參與了AS和PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)生發(fā)展。多種生長因子、細(xì)胞因子、粘附分子等參與其病理生理過程，單純抑制某種特定的因子并不能完全抑制病灶形成。因此，阻斷由H2O2損傷引起的平滑肌細(xì)胞增殖、分化、遷移、炎癥反應(yīng)等最終共同的關(guān)鍵靶向轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號通路，探求內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)措

3、施，成為有效防止血管增生性疾病的研究方向。 鋅指蛋白A20是一種泛素調(diào)節(jié)酶，通過泛素化和去泛素化負(fù)反饋調(diào)節(jié)NF-κB信號系統(tǒng)，近年研究表明鋅指蛋白A20抑制多種炎性細(xì)胞誘導(dǎo)NF-κB激活所引起的血管平滑肌細(xì)胞增殖，是非常重要的細(xì)胞內(nèi)源性自我保護(hù)蛋白。對于A20抗氧化損傷方面的研究甚少，本研究旨在通過采用鋅指蛋白A20基因干擾和轉(zhuǎn)染技術(shù)對其表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，觀察其對H2O2誘導(dǎo)的人臍動脈血管平滑肌細(xì)胞HUASMc增殖和NF-κB、酪氨

4、酸蛋白激酶Syk、細(xì)胞周期蛋白D1 CyclinD1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑P21表達(dá)及NF-κB下游炎癥因子TNF-α的影響，以探討鋅指蛋白A20在氧化還原方面對細(xì)胞的保護(hù)作用，為血管增生性疾病的防治尋求新的途徑。 方法： 1）設(shè)計并體外化學(xué)合成三條人A20的siRNA序列，通過A20mRNA及蛋白測定篩選出對人A20基因具有較高干擾效率的siRNA序列。將培養(yǎng)的HUASMc隨機(jī)分為六組：空白組（培養(yǎng)基培養(yǎng)，未給

5、與任何干預(yù)）；A20siRNA組（轉(zhuǎn)染A20siRNA24小時）；scramble siRNA組（轉(zhuǎn)染陰性對照scramble siRNA24小時）；H2O2組（100μmol/LH2O2持續(xù)刺激6小時）；A20siRNA+H2O2組（轉(zhuǎn)染A20siRNA24小時后100μmol/L H2O2持續(xù)刺激6小時）；scramble siRNA+H2O2組（轉(zhuǎn)染陰性對照scramble siRNA24小時后100μmol/L H2O2持續(xù)刺激

6、6小時）。應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）方法測定細(xì)胞增殖活性；流式細(xì)胞技術(shù)觀察血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞周期的變化；RT-PCR方法觀察A20mRNA表達(dá)變化；Western-blotting方法觀察A20、NF-κB p65、Syk、CyclinD1、P21蛋白含量表達(dá)。雙抗體夾心ELISA方法檢測上清液TNF-α表達(dá)水平； 2）pCAGGS-GFP/A20質(zhì)粒菌保涂Amp抗性的平板后，過夜培養(yǎng)。挑單菌落于3ml Amp抗性的LB培養(yǎng)基

7、中37℃搖床中過夜培養(yǎng)，集菌后，進(jìn)行小量質(zhì)粒提取，并使用EcoRⅤ/SmaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳。將鑒定好的質(zhì)粒菌保進(jìn)行無內(nèi)毒素質(zhì)粒的大量提取，將質(zhì)粒DNA提取物按適當(dāng)比例稀釋，并測定濃度。將培養(yǎng)的HUASMc隨機(jī)分為四組：空白組（為空白對照組，不加任何干預(yù)因素）；H2O2組（在培養(yǎng)基100μmol/L的H2O2作用6小時）；A20組（向HUASMc轉(zhuǎn)染含A20基因的質(zhì)粒后培養(yǎng)24小時）；A20+H2O2組（先向H

8、UASMc轉(zhuǎn)染含A20基因的質(zhì)粒，培養(yǎng)24小時后在培養(yǎng)基中加入100μmol/L的H2O2作用6小時）。應(yīng)用四甲基偶氮嘩藍(lán)（MTT）方法測定細(xì)胞增殖活性；流式細(xì)胞技術(shù)觀察血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞周期的變化；Western-blotting方法觀察NF-κB p65、Syk、CyclinD1、 P21蛋白含量表達(dá)。雙抗體央心ELISA方法檢測培養(yǎng)液TNF-α表達(dá)水平； 3）體外培養(yǎng)HUASMc，以H2O2作為刺激因素，以不同濃度大黃素（

9、EMD）作為干預(yù)因素，采用MTT比色、BrdU摻入法測定細(xì)胞增殖；采用RT-PCR方法檢測A20mRNA表達(dá)水平；采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測A20、NF-κB蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果： 1）與對照組比較，轉(zhuǎn)染A20siRNA的HUASMc中A20mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低，以siRNAc最顯著，干擾效率大約55%，MTT結(jié)果顯示H2O2可誘導(dǎo)HUASMc增殖，H2O2后A20干擾對平滑肌細(xì)胞增殖活性有協(xié)同作用。流式檢測結(jié)果

10、表明H2O2組S期、G2/M期構(gòu)成百分比，增殖指數(shù)均較空白組明顯增加；與H2O2組比較，H2O2+A20干擾后，細(xì)胞S期構(gòu)成比和增殖指數(shù)明顯升高。H2O2刺激后A20mRNA與A20蛋白、NF-κB p65、Syk、cyclinD蛋白表達(dá)增加； P21蛋白表達(dá)量降低。A20干擾后使H2O2引起的上述變化趨勢更加顯著。雙抗體夾心ELISA結(jié)果示培養(yǎng)的細(xì)胞液中A20干擾后增加了H2O2所誘導(dǎo)的NF-κB p65下游的細(xì)胞炎癥因子TNF-α表

11、達(dá)水平； 2）將提取的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-GFP/A20使用EcoRⅤ/SmaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，質(zhì)粒大小及酶切結(jié)果正確。轉(zhuǎn)染含A20基因質(zhì)粒的HUASMc MTT細(xì)胞增殖活性降低，阻止細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期，有效抑制H2O2刺激的HUASMc增殖。明顯抑制H2O2所誘導(dǎo)的NF-κB p65、Syk、CyclinD、TNF-α蛋白表達(dá)的增高。顯著逆轉(zhuǎn)H2O2引起的P21蛋白含量的下調(diào)；

12、 3）在10～80μmol·L-1范圍內(nèi)，隨EMD濃度加大，MTTOD值及BrdU摻入OD值均逐漸變小，對H2O2誘導(dǎo)的HUASMc增殖具有抑制作用，且呈劑量依賴性。同時可呈劑量依賴性使HUASMc中A20mRNA和蛋白表達(dá)增加，NF-κBp65蛋白表達(dá)減少。 結(jié)論： 1）H2O2可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HUASMc增殖及炎癥反應(yīng)，激活Syk/NF-κB信號通路，上調(diào)Syk、NF-κB p65、CyclinD1的表達(dá)，下調(diào)P

13、21表達(dá)，促進(jìn)炎癥因子TNF-α的產(chǎn)生； 2）A20siRNA干擾可以抑制HUASMc內(nèi)源性A20mRNA和蛋白表達(dá)，具RNAi作用； 3）A20干擾可減弱內(nèi)源性A20對H2O2/Syk/NF-κB p65信號通路的負(fù)反饋抑制作用，上調(diào)Syk、NF-κB p65、CyclinD1表達(dá)，下調(diào)P21表達(dá)，增加炎癥因子TNF-α表達(dá)，增強(qiáng)H2O2刺激引起的HUASMc增殖活性及炎癥反應(yīng)； 4）A20基因轉(zhuǎn)染可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)

14、A20的表達(dá)，增強(qiáng)對H2O2/Syk/NF-κB p65信號通路負(fù)反饋抑制作用，下調(diào)CyclinD1表達(dá)，上調(diào)P21表達(dá)，改善細(xì)胞周期蛋白/細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的平衡關(guān)系，減少炎癥因子TNF-α產(chǎn)生，從而達(dá)到抑制氧化應(yīng)激損傷所引起的VSMC增殖及炎癥反應(yīng)； 5）干預(yù)A20可能成為防治動脈粥樣硬化的新靶點，上調(diào)A20可能成為防治動脈粥樣硬化性疾病的新方法； 6）EMD對H2O2誘導(dǎo)的HUASMc增殖具有抑制作用，其