懷菊花響應(yīng)黑斑病病原菌相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析.pdf

1、懷菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）是我國著名的“四大懷藥”之一，有著巨大的商業(yè)價值。在生產(chǎn)上，由鏈格孢屬真菌引起的黑斑病是造成懷菊花產(chǎn)量和品質(zhì)下降的重要因素之一，種植抗病品種能夠有效地防控該病的發(fā)生和流行，目前，從分子水平上培育菊花抗病品種的育種技術(shù)安全可靠，但有關(guān)懷菊花響應(yīng)黑斑病病原菌侵染的分子機制的研究有待繼續(xù)深入。為了從轉(zhuǎn)錄組水平上研究懷菊花響應(yīng)鏈格孢屬交鏈孢菌(Alternaria sp.)

2、引起的黑斑病的應(yīng)答反應(yīng)，本研究以懷菊花接種無菌水0d（對照）及接種A.sp.后3d和5d的葉片為材料，提取總RNA，構(gòu)建樣品的cDNA文庫，利用IlluminaHiSeq2000測序平臺進行了轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)果如下:
　　1.獲得了懷菊花響應(yīng)黑斑病病原菌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組測序的基本信息。本次測序共獲得了544，411，736個Raw Reads，對其進行過濾之后，Cm_CK0_1、Cm_ CK0_2、Cm_ CK0_3、Cm_ A3

3、_1、Cm_ A3_2、Cm_ A3_3、Cm_A5_1、Cm_A5_2、Cm_A5_3分別獲得了56,583,406、62,933,114、53,182,862、62,100,372、47,401,094、62,287,656、66，060，304、58，149，022、57，499，778個高質(zhì)量的clean reads，共58.6 G的數(shù)據(jù)量，每個樣品中堿基識別正確率達99％的序列均在94％以上，拼接組裝后，取最長轉(zhuǎn)錄本作為Uni

4、gene，共得到了350，833個轉(zhuǎn)錄本和162，252條Unigene，平均長度分別為822 bp和701 bp，最短的均為201 bp，最長的均為106，811 bp，中等長度的分別為537 bp和397 bp，轉(zhuǎn)錄本和Unigene的長度在500 bp以上的分別有185，500和64，500個，各占52.9％和39.8％，在1000 bp以上的分別有92，614和30，545個，各占26.4％和18.8％，拼接得到的短序列占比多于

5、長序列，符合轉(zhuǎn)錄組序列長度分布的一般規(guī)律。
　　2.獲得了Unigene在多個數(shù)據(jù)庫中的功能注釋信息。通過Blast將Unigene序列與蛋白數(shù)據(jù)庫NR、GO、KOG、KEGG、SwissProt、PFAM及核酸數(shù)據(jù)庫NT進行比對，對于比對時設(shè)置的E-value閾值，NR、NT、SwissProt、KOG均為1e-5，GO為1e-6，KEGG為1e-10，其中至少在一個數(shù)據(jù)庫注釋上的Unigene共有57，890條，占35.67％

6、，在7個數(shù)據(jù)庫同時注釋上的Unigene共5124條，NR蛋白數(shù)據(jù)庫注釋上了48，795條，NT核酸數(shù)據(jù)庫注釋上了17，796條。
　　3.得到了Unigene的GO、KOG及KEGG功能分類信息。基于Nr及Pfam兩個數(shù)據(jù)庫的注釋信息，被歸類到GO功能分類三個大類的37，239(23％)條Unigene共涉及到56個更為具體的亞類。三個大類生物學(xué)過程、細胞成分及分子功能各有89，121(54.9％)、55，661(34.3％)和

7、45，263(27.9％)條Unigene;亞類中結(jié)合(binding)及細胞過程(cellular process)包含的Unigene數(shù)目最多，分別有21，179(56.9％)和20，485(55.0％)。共有16，034條Unigene在KOG數(shù)據(jù)庫被注釋到了25個功能類別上，其中R類一般功能預(yù)測（general function prediction only）包含3037個Unigene，數(shù)目最多，占19.0％。根據(jù)14，35

8、6條Unigene的KEGG注釋進行了Pathway一二三級分類，KEGG代謝通路一級分類的5個大分支在二級分類中被分為32條通路，其中被注釋到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(signal transduction)的Unigene數(shù)目最多，有1673條，占11.7％，在三級分類中被分為276條通路，碳代謝(carbon metabolism)途徑Unigene數(shù)目最多，有537條，占3.47％，此外，與抗病相關(guān)的代謝途徑，如植物激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(plan

9、t hormone signaltransduction)和植物與病原菌互作(plant-pathogen interaction)等分別有381和363條Unigene。
　　4.初步了解了Unigene的結(jié)構(gòu)信息。對Unigene的蛋白編碼序列(CDS)和微衛(wèi)星位點(SSR)進行分析，共得到了85，218條Unigene的CDS序列及分布在14，705條Unigene序列中的16，581個SSR位點，其中CDS長度分布在201

10、～300 bp的Unigene最多，SSR類型中單核苷酸重復(fù)類型最多。
　　5.基本明確了差異表達基因的相關(guān)信息。
　　(1)Cm_A3vsCm_ CK0和Cm_ A5 vsCm_CK0之間符合|log2foldchange|＞1的條件的差異表達基因分別有16，550和13，559條，其中有8422個共表達差異基因;
　　(2)GO富集到的功能類別中蛋白磷酸化(proteinphosphorylation)和蛋白激酶活

11、性(protein kinase activity)最顯著，KEGG顯著性富集到了植物與病原菌的互作(plant-pathogen interaction)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormonesignal transduction)、苯丙烷的生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)、類黃酮生物合成(flavonoid biosynthesis)等代謝通路，以植物與病原菌的互作和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最

12、顯著。顯著性富集到的這些功能類別和代謝通路大多數(shù)與植物抗病相關(guān)且差異表達基因上調(diào)的明顯多于下調(diào)的，此外，那些參與光合作用等的代謝通路相關(guān)的一些差異表達基因則被顯著性下調(diào);
　　(3)懷菊花在黑斑病的脅迫下，啟動了SA、JA/Eth、MAPK、Ca2+介導(dǎo)的多條信號途徑，可能通過調(diào)節(jié)活性氧的平衡來抵御病原菌的入侵，激活了WRKY、ERF、MYB、bHLH、NAC等大量的與抗病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子高表達，其中MPK6/MPK3途徑及WRKY