海參養(yǎng)殖池微生物多樣性及其動(dòng)態(tài)研究.pdf

1、海參養(yǎng)殖業(yè)是我國(guó)特色海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)之一，主要分布在遼寧和山東沿海。海參養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，2010年全國(guó)海參養(yǎng)殖面積已達(dá)到萬(wàn)公頃，產(chǎn)量達(dá)萬(wàn)噸，產(chǎn)值接近億元。然而，相對(duì)于其迅速發(fā)展的規(guī)模，與海參養(yǎng)殖技術(shù)相關(guān)的基礎(chǔ)研究還比較滯后。因此，相關(guān)基礎(chǔ)研究越來(lái)越受到人們的重視。
　　海參養(yǎng)殖環(huán)境中微生物有著十分重要的地位，大部分微生物以生產(chǎn)者或分解者作用參與水生生態(tài)系統(tǒng)，部分寄生或共生型病原微生物會(huì)造成海參疾病爆發(fā)，與海參的健康生長(zhǎng)有著十分緊密的聯(lián)

2、系。而在人工養(yǎng)殖過(guò)程中，不規(guī)范的投放餌料、藥物濫用等造成池底物質(zhì)堆積，往往會(huì)導(dǎo)致水體微生態(tài)平衡受到嚴(yán)重破壞，水質(zhì)惡化、缺氧等，造成海參免疫力下降或死亡;另外，水體富營(yíng)養(yǎng)化也會(huì)造成水體優(yōu)勢(shì)青苔與養(yǎng)殖生物餌料藻類(lèi)競(jìng)爭(zhēng)，造成底質(zhì)腐敗等，進(jìn)而給海參養(yǎng)殖造成直接或間接的負(fù)面影響。因此，海參養(yǎng)殖環(huán)境的健康狀況與微生物群落的豐度、群落結(jié)構(gòu)有著緊密的聯(lián)系，探究養(yǎng)殖環(huán)境中微生物群落的組成與動(dòng)態(tài)變化對(duì)于海參養(yǎng)殖業(yè)具有重要的理論和實(shí)踐意義。
　　基于以

3、上背景，本工作對(duì)海參養(yǎng)殖池塘中的微生物多樣性和年度動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)水體中浮游微生物豐度;通過(guò)高通量測(cè)序檢測(cè)真菌、古菌、細(xì)菌等不同類(lèi)型的微生物多樣性及其豐度變化;利用連續(xù)流動(dòng)分析儀對(duì)海參養(yǎng)殖水體的環(huán)境因子進(jìn)行測(cè)定;綜合群落結(jié)構(gòu)和環(huán)境因子尋找影響微生物群落變化的制約性因素。另外，針對(duì)青苔爆發(fā)頻繁的實(shí)際性問(wèn)題，利用特異性引物設(shè)計(jì)和定量PCR技術(shù)相結(jié)合，探討檢測(cè)海參養(yǎng)殖池中青苔孢子的分子檢測(cè)方法，以期達(dá)到對(duì)青苔爆發(fā)的早期預(yù)

4、警。本研究旨在為海參養(yǎng)殖池塘環(huán)境微生物生態(tài)調(diào)控模式的建立提供一定的基礎(chǔ)資料。主要研究結(jié)果如下:
　　1.海參養(yǎng)殖池浮游微生物的分布
　　利用流式細(xì)胞儀技術(shù)研究了海參養(yǎng)殖池塘水體環(huán)境浮游微生物豐度變化及其與環(huán)境因子的關(guān)系。
　　結(jié)果表明:
　　(1)浮游微生物檢測(cè)出聚球藻、皮微級(jí)浮游植物、納微級(jí)浮游植物、隱藻、高低核酸異養(yǎng)細(xì)菌幾大類(lèi)型，其中細(xì)菌數(shù)量級(jí)非常大，幾乎達(dá)到106/mL，而浮游植物的數(shù)量級(jí)較小，只有102/

5、mL～103/mL。
　　(2)浮游微生物一般都是3月開(kāi)始生長(zhǎng)，到6月份處于爆發(fā)頂峰期，9月份的時(shí)候已經(jīng)處于衰退期。
　　(3)浮游微生物數(shù)量與環(huán)境中的溶解氧，鹽度、pH、可溶性總氮具有一定的相關(guān)關(guān)系，其中，溶解氧和pH對(duì)于浮游微生物的影響是最大的。
　　2.海參養(yǎng)殖池微生物多樣性分析
　　水樣過(guò)濾膜提取DNA，并進(jìn)行高通量測(cè)序，再結(jié)合環(huán)境因子對(duì)比，研究海參養(yǎng)殖池微生物多樣性。
　　結(jié)果表明:
　　(

6、1)細(xì)菌中變形菌門(mén)是重要組成部分，其中α-變形菌（Alphaproteobacteria）是主要類(lèi)群。CCA分析結(jié)果顯示，原核生物類(lèi)群受pH、亞硝態(tài)氮、硅、氨態(tài)氮、溫度控制。
　　(2)古菌生物中，大部分樣品優(yōu)勢(shì)類(lèi)群是DHVEG-6。而且大部分古菌如DHVEG6、MHVG、GroupC3、MBGB等都與各種形態(tài)可溶性氮元素有著顯著甚至是極顯著相關(guān)性。CCA分析的結(jié)果顯示出微生物群落受鹽度和硅控制。
　　(3)真核微生物中泛植

7、物界占據(jù)主要組成部分，而在泛植物界中綠藻門(mén)是最主要的。CCA結(jié)果顯示生物類(lèi)群受鹽度、溫度、pH、溶解氧、亞硝態(tài)氮、氮磷比控制影響。
　　3.海參養(yǎng)殖池三種藻類(lèi)孢子/配子qPCR檢測(cè)
　　對(duì)海參養(yǎng)殖池三種爆發(fā)性青苔進(jìn)行了18S和ITS區(qū)間測(cè)序，設(shè)計(jì)了以核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)為靶區(qū)域的種類(lèi)特異性PCR引物，通過(guò)藻類(lèi)和環(huán)境水樣DNA對(duì)照實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)其特異性和適用性。
　　結(jié)果如下:
　　(1)所得三種藻類(lèi)ITS引物均具

8、有一定種類(lèi)或類(lèi)群特異性。
　　(2)三對(duì)引物在qPCR方法中呈現(xiàn)一定的靈敏度，三株藻類(lèi)最低檢出限度:緣管石莼約1.66×10-4 ng/μL，200個(gè)ITS基因拷貝數(shù);未能鑒定到種約6.6×10-6 ng/μL，200個(gè)ITS基因拷貝數(shù);萱藻1.66×10-4 ng/μL，400個(gè)ITS基因拷貝數(shù)。
　　(3)使用qPCR方法對(duì)煙臺(tái)海參養(yǎng)殖水體6個(gè)季度環(huán)境水樣中的萱藻孢子/配子進(jìn)行定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)樣品中萱藻孢子/配子ITS拷貝