諾帝對HPV16亞基因永生化人宮頸上皮細胞的作用.pdf

1、第一部分 目的：研究諾帝(Nordy)對HPV16型亞基因(E6、E7)永生化人宮頸上皮細胞(H8細胞)增殖，分化和凋亡的影響作用及機制。 方法：MTT法檢測諾帝對H8細胞增殖的抑制作用；免疫細胞化學SP法檢測微小染色體維持蛋白(minichromosome maintenance MCM)mcm5的表達；流式細胞術(FCM)和Annexin V-FITC法分析細胞周期和凋亡；光鏡、電鏡觀察細胞形態(tài)變化。 結果：

2、①10umol/L、50umol/L、75 umol/L和100umol/L濃度的諾帝能夠不同程度地抑制H8細胞增殖，且這種抑制作用呈劑量-時間依賴方式。②免疫細胞化學顯示經(jīng)100umol/L諾帝處理72h后，H8細胞核內mcm5蛋白表達明顯減弱。③FCM結果顯示：10 umol/L、50 umol/L、75 umol/L、100 umol/L的諾帝處理H8細胞72h后，與對照組相比，G0/G1期細胞數(shù)明顯增加，S期和G2/M期細胞數(shù)明

3、顯減少，并呈濃度依賴性，諾帝作用后H8細胞的增殖明顯受到抑制，細胞被阻滯在G0/G1期。用100 umol/L和200umol/L諾帝處理H8細胞48h后，用Annexin V-FIIC法分析，結果顯示實驗組細胞凋亡率(分別為12.322±0.786％和24.330±3.228％)明顯高于對照組細胞的凋亡率(3.478±1.519％)，差異具有顯著性，這提示一定濃度的諾帝可以促進H8細胞凋亡的發(fā)生。④光鏡下觀察，諾帝作用H8細胞后，可見

4、細胞體積變小且較規(guī)則，核分裂像明顯減少，核/質比例下降。電鏡觀察細胞核變小變規(guī)則，異染色質增多，核逐漸成熟，成熟的線粒體，內質網(wǎng)等細胞器增多，細胞形態(tài)朝良性方向分化。同時細胞凋亡增多，出現(xiàn)明顯的凋亡小體。 結論：諾帝具有抑制H8細胞增殖，促進凋亡，誘導其分化作用，這種作用可能是通過諾帝抑制H8細胞在S期進行DNA合成，使細胞增殖受阻于G<,0>/G<,1>期，同時降低mcm5蛋白活性的表達來實現(xiàn)的。 第二部分 目

5、的：研究諾帝(Nordy)對永生化人宮頸上皮細胞(H8細胞)HPV16 E6基因的抑制作用和機制。 方法：免疫細胞化學SP法檢測諾帝作用前后H8細胞E6蛋白和P53蛋白表達；RT-PCR檢測諾帝作用前后HPV16E6 mRNA的表達情況。 結果：①免疫細胞化學顯示，E6和P53蛋白在對照組細胞內呈陽性表達，陽性物分別位于胞漿和胞核，經(jīng)100umol/L諾帝處理72h后，H8細胞E6蛋白和P53蛋白表達明顯減弱，與對照組相

6、比，差異有顯著性。②用濃度10umol/L、50umol/L、100umol/L、200umol/L諾帝處理H8細胞72小時后，濃度為10umol/L的諾帝作用后H8細胞的HPV 16E6 mRNA的表達量與對照組的表達量無明顯差異，而較高濃度的諾帝(50umol/L，100umol/L，200umol/L)處理H8細胞72小時后H8細胞的HPV16E6 mRNA的表達量相比對照組有明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。