人纖溶酶原K5抑制胃癌生長及機(jī)制研究.pdf

1、人纖溶酶原（plasminogen）含有5個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域（kringles），水解后可產(chǎn)生一組具有抑制血管增生作用的小分子片段：Angiostatin（kringles1—4），kringles1—5，kringles1—3和kringles5（K5），具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生的作用。血管抑素（Angiostatin）用于腫瘤的治療已進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)階段。較之血管抑素（分子量約45KDa），K5具有分子量小（16KDa）、性質(zhì)穩(wěn)定且活性更強(qiáng)的

2、優(yōu)點(diǎn)。 在腫瘤組織中由于腫瘤細(xì)胞快速生長，造成局部微環(huán)境相對缺氧。HIF—1a是細(xì)胞在低氧狀態(tài)下被活化的最重要的核轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞內(nèi)氧適應(yīng)調(diào)節(jié)因子，它能和靶基因啟動(dòng)子中缺氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合調(diào)控靶基因如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、紅細(xì)胞生成素（EPO）等的表達(dá)，在介導(dǎo)缺氧微環(huán)境促進(jìn)惡性實(shí)體瘤生長和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。 血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種很強(qiáng)的血管增生刺激因子，幾乎所有的實(shí)體瘤細(xì)胞都能分泌。腫瘤細(xì)胞分泌的

3、VEGF可誘導(dǎo)或調(diào)控腫瘤的血管形成及新生血管的結(jié)構(gòu)和功能異常，從而支持腫瘤生長。一方面以旁分泌的方式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，引發(fā)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，刺激內(nèi)皮細(xì)胞分化和血管生成；另一方面，以自分泌的方式與腫瘤細(xì)胞上的Flt—1或KDR受體結(jié)合可刺激腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移。目前對K5的研究大多數(shù)集中在其對內(nèi)皮細(xì)胞的作用，而對腫瘤細(xì)胞直接作用的研究甚少。以往研究證實(shí)在微血管內(nèi)皮細(xì)胞K5能通過下調(diào)核內(nèi)HIF—1a而抑制VEGF表

4、達(dá)，具體機(jī)制未見深入研究。K5能否通過對腫瘤細(xì)胞HIF—1a信號(hào)調(diào)控途徑的抑制而在腫瘤生長的防治中發(fā)揮潛在的抗瘤活性，尚未有系統(tǒng)研究。 綜上所述，本課題擬從K5抑制胃癌生長進(jìn)行深入研究：（1）表達(dá)純化K5（2）在細(xì)胞水平和腫瘤模型上證明K5對腫瘤生長的抑制作用。（3）以SGC7901胃癌細(xì)胞為研究對象，從HIF—1a調(diào)控VEGF細(xì)胞信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探索K5對核轉(zhuǎn)錄因子HIF—1a及VEGF的作用，揭示K5抑制腫瘤生長的分子機(jī)制

5、。 主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 第1部分K5表達(dá)及純化 1．獲得高純度可溶性的重組蛋白。鑒定正確的重組體轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）宿主菌中，經(jīng)IPTG低溫誘導(dǎo)，可表達(dá)出可溶性重組蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌經(jīng)溶菌酶充分消化后，離心取上清，用Ni2+—His Bind Resin親和柱純化，獲得高純度可溶性蛋白。用凝膠成像系統(tǒng)（GENE GENIUS公司產(chǎn)品）對凝膠進(jìn)行灰度掃描，結(jié)果顯示純化后重組蛋白純度可達(dá)：K5約為92．6

6、%，純化的重組蛋白經(jīng)Western—blot分析顯有明顯的免疫雜交帶。 第2部分K5蛋白抑制胃癌生長的體內(nèi)外研究 1．K5對培養(yǎng)的SGC—7901細(xì)胞增殖的影響。K5無明顯地抑制SGC—7901細(xì)胞增殖的作用。 2． K5抑制胃癌裸鼠腫瘤生長的效應(yīng)。腹腔注射K5總劑量為12．5mg/kg時(shí)，對BALB/c裸鼠胃癌（SGC—7901）實(shí)體瘤生長具有顯著的抑制作用，抑瘤率為67%。 第3部分K5抑制胃癌生長的

7、分子機(jī)制初步探討 1．K5對HIF—1a具有下調(diào)作用，并抑制其核轉(zhuǎn)位。通過SP免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western—blot分析，結(jié)果顯示K5在低氧下對SGC—7901胃癌細(xì)胞具有下調(diào)HIF—1a并抑制其核轉(zhuǎn)位，而在常氧下無明顯的作用。 2． K5下調(diào)SGC—7901胃癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)。通過SP免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western—blot分析，顯示K5在低氧下對SGC—7901胃癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)具有下調(diào)作用，并呈劑量依賴性

8、；在常氧下變化不明顯。 結(jié)論及研究意義: 1．獲得其基因工程純化蛋白。 2．首次發(fā)現(xiàn)K5具有抑制胃癌生長的作用。 3．首次在SGC—7901胃癌細(xì)胞異種種植裸鼠模型上，闡述了K5抑制腫瘤新生血管從而抑制腫瘤生長的機(jī)制：K5通過下調(diào)HIF—1a和抑制其核轉(zhuǎn)位來降低VEGF的表達(dá)。在SGC—7901胃癌細(xì)胞腫瘤上，腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF通過旁分泌作用于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，影響腫瘤血管增生從而抑制腫瘤生長。該研究