禽腺相關(guān)病毒基因序列對(duì)雞輸卵管特異表達(dá)人溶菌酶的影響.pdf

1、腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)是基因治療的良好載體，特別是人AAV載體，因能將目的基因定點(diǎn)整合至人19號(hào)染色體的AAVSl部位所以格外引起人們的興趣。禽腺聯(lián)病毒(avian adeno-associated virus，AAAV)與人AAV具有類(lèi)似的潛伏感染特性和基因組結(jié)構(gòu)，提示具有定點(diǎn)整合外源基因的可能。為了探索AAAV的反向末端重復(fù)序列(ITR)和Rep基因序列能否促進(jìn)外源基因的整合和表達(dá)，本研究

2、將人溶菌酶(hLYZ)雞輸卵管特異表達(dá)盒克隆在AAAV的兩個(gè)ITR之間，并將CMV啟動(dòng)子控制的Rep基因表達(dá)盒克隆入相同載體，獲得重組表達(dá)載體pRep2ITR-OV4-IYZ。以不含AAAV基因序列的雞輸卵管表達(dá)載體pOV4-LYZ為對(duì)照，經(jīng)翅靜脈注射產(chǎn)蛋雞，注射劑量均為10<'14>拷貝，隔天重復(fù)注射一次。載體注射雞蛋清中的重組酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，重組載體pRep2ITR-OV4-LYZ表達(dá)的hLYZ水平和表達(dá)維持時(shí)間優(yōu)于pOV4-L

3、YZ。用重組載體pRep2ITR-OV4-LYZ連續(xù)3次注射產(chǎn)蛋雞，結(jié)果顯示連續(xù)3次載體注射的重組酶表達(dá)量和時(shí)間略?xún)?yōu)于連續(xù)兩次注射。這些試驗(yàn)結(jié)果提示，上述AAAV基因序列對(duì)重組載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染或外源基因整合具有一定的促進(jìn)作用，但不足以顯著延長(zhǎng)外源基因的表達(dá)。 為了探索用雞輸卵管表達(dá)的重組人溶菌酶防治魚(yú)細(xì)菌性疾病的可行性，用直接結(jié)晶法提純雞蛋清中的溶菌酶，經(jīng)SDS-PAGE分析證明提取的溶菌酶純度較高，用純化的重組人溶菌酶進(jìn)行魚(yú)類(lèi)細(xì)