HCN4在微波輻射致大鼠竇房結(jié)損傷中的作用研究.pdf

1、目的和意義:
　　隨著微波技術(shù)的飛速發(fā)展和信息時(shí)代的來臨,人們?cè)谙硎鼙憬萆畹耐瑫r(shí),也面臨著微波污染的危害。此外,微波技術(shù)在軍事上的應(yīng)用發(fā)展迅速,它不僅能嚴(yán)重破壞敵方電子設(shè)備,同時(shí)也能造成機(jī)體損傷。心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)是微波輻射敏感的靶標(biāo)之一,SAN是心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)最重要的組成部分。然微波輻射致SAN損傷規(guī)律及量效關(guān)系未明,其致傷機(jī)制尚未見報(bào)道。HCN4可調(diào)控P細(xì)胞的起搏電流及維持其電生理功能。SAN組織中HCN4的異常表達(dá)可能是各種SAN

2、病變發(fā)生的分子基礎(chǔ)之一,而HCN4及其調(diào)控可能在微波輻射致大鼠SAN損傷中發(fā)揮重要作用。因此,研究微波輻射致SAN損傷中HCN4的改變、調(diào)控及其意義,將為深入研究微波輻射致心臟損傷的分子機(jī)制和防治措施提供新靶標(biāo)和思路,為尋找敏感診斷指標(biāo)和制定防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料和方法:
　　(1)大鼠SAN定位及組織結(jié)構(gòu)觀察:采用二級(jí)Wistar成年大鼠20只,對(duì)右心房及與之相連的近段上腔靜脈做水平連續(xù)切片,對(duì)切片行HE、Mas

3、son染色,光鏡下觀察連續(xù)切片,定位SAN并觀察組織結(jié)構(gòu)。
　　(2)大鼠SAN超微結(jié)構(gòu)觀察:采用二級(jí)雄性Wistar成年大鼠10只,依據(jù)SAN位置、組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分兩步取材,經(jīng)樹脂定向包埋,半薄切片甲苯胺藍(lán)預(yù)染,光鏡下定位后,再行超薄切片,透射電鏡觀察SAN超微結(jié)構(gòu)。
　　(3)微波輻射對(duì)大鼠SAN功能和結(jié)構(gòu)的影響研究:采用平均功率密度為0、5、10、50mW/cm2的脈沖微波輻射160只二級(jí)雄性Wistar大鼠,輻射時(shí)間為

4、6min,于輻射前、輻射后即刻、7d、14d、28d、3m、6m和9m,采用多道生理記錄儀檢測(cè)大鼠ECG的變化;于輻射后1d、7d、14d、28d、3m、6m、9m、12m,采用光鏡和電鏡觀察大鼠SAN組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)變化;采用Masson染色、天狼猩紅染色和圖像分析技術(shù),觀察SAN組織膠原纖維含量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。
　　(4)微波輻射后大鼠SAN組織HCN4改變及其調(diào)控機(jī)制研究:采用ISH、IHC和圖像分析等方法,檢測(cè)50mW/

5、m2微波輻射后大鼠SAN組織中HCN4及其上游分子β1-AR、M2-AchR基因和/或蛋白的表達(dá)變化。
　　(5)微波輻射對(duì)原代培養(yǎng)乳鼠SAN細(xì)胞的損傷效應(yīng)及機(jī)制研究:以體外原代培養(yǎng)的SAN細(xì)胞為研究對(duì)象,采用倒置顯微鏡、AFM、LSCM、IF等技術(shù),觀察微波輻射對(duì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、搏動(dòng)特征、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]及HCN4表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)正常成年大鼠SAN位置和組織學(xué)特點(diǎn):正常成年大鼠SAN位

6、于上腔靜脈與右心耳交界區(qū)及其以上的上腔靜脈壁內(nèi),呈馬蹄形/C形;大鼠SAN組織結(jié)構(gòu)疏松,主要含有P細(xì)胞、T細(xì)胞和少量心房肌細(xì)胞,間質(zhì)膠原纖維含量豐富。
　　(2)正常成年大鼠SAN超微結(jié)構(gòu)觀察:甲苯胺藍(lán)預(yù)染半薄切片的方法簡(jiǎn)便迅速,著色效果好,可有效縮短定位時(shí)間。電鏡觀察顯示,大鼠SAN內(nèi)主要含有兩種細(xì)胞。
　　①P細(xì)胞:胞體小,胞漿豐富,細(xì)胞器含量少;肌原纖維含量少,雜亂分布于細(xì)胞膜附近,幾乎不含肌節(jié);
　?、赥細(xì)胞:

7、胞體較P細(xì)胞大,細(xì)胞器含量較多,肌原纖維可見明顯肌節(jié),常沿細(xì)胞縱軸排列,分布于細(xì)胞膜附近。
　　(3)微波輻射對(duì)大鼠SAN功能的影響:5mW/cm2組未見明顯異常;10和50mW/cm2微波輻射后大鼠SAN功能受損,主要表現(xiàn)為:心率呈先加快后減慢趨勢(shì);P波振幅降低;ECG出現(xiàn)竇性心律不齊、SAN內(nèi)游走性心律和房性心律失常等。
　　(4)微波輻射后大鼠SAN組織結(jié)構(gòu)變化:5mW/cm2組未見明顯異常;10和50mW/cm2微波

8、輻射后1d,表現(xiàn)為P、T細(xì)胞水腫;T細(xì)胞排列呈波浪狀改變;14~28d損傷最重,表現(xiàn)為細(xì)胞排列紊亂,部分細(xì)胞胞漿嗜酸性染色增強(qiáng),核固縮深染;3m~6m損傷減輕呈恢復(fù)趨勢(shì),仍有部分細(xì)胞呈水腫狀態(tài);9m~12m表現(xiàn)為實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少,間質(zhì)膠原纖維增多及脂肪浸潤。以上改變尤以50mW/cm2組最為顯著。
　　(5)微波輻射后大鼠SAN超微結(jié)構(gòu)變化:5mW/cm2組未見明顯異常;10和50mW/cm2微波輻射后1d~28d表現(xiàn)為P、T細(xì)胞線粒

9、體最早受累,出現(xiàn)腫脹,嵴斷裂,甚至空化;肌原纖維局灶性溶解、斷裂;可見P、T細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、邊集;細(xì)胞膜小凹減少或消失;血管周圍間隙增寬、水腫;6m~12m表現(xiàn)為實(shí)質(zhì)細(xì)胞退行性變,間質(zhì)膠原原纖維增多、脂肪浸潤。以上改變尤以50mW/cm2組最為顯著。
　　(6)微波輻射致大鼠SAN損傷后HCN4、β1-AR、M2-AchR變化:50mW/cm2微波輻射后1d~28d,大鼠SAN組織中HCN4mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05或P<0

10、.01),3m表達(dá)下調(diào)(P<0.05);HCN4蛋白于輻射后1d~28d表達(dá)增加(P<0.05或P<0.01),3m~6m表達(dá)降低(P<0.05);β1-ARmRNA于輻射后1d~3m表達(dá)上調(diào)(P<0.05或P<0.01);β1-AR蛋白于輻射后1d~3m表達(dá)增加(P<0.05或P<0.01);M2-AchR蛋白于輻射后1d~6m表達(dá)增加(P<0.05或P<0.01)。
　　(7)微波輻射后體外培養(yǎng)SAN細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、搏動(dòng)特征變化

11、:正常SAN細(xì)胞呈長梭形,伸出偽足或突起與周圍細(xì)胞連接成片,呈單個(gè)細(xì)胞搏動(dòng),搏動(dòng)速度快,節(jié)律規(guī)則。10和50mW/cm2微波輻射后,SAN細(xì)胞搏動(dòng)明顯減慢且節(jié)律不規(guī)則,細(xì)胞腫脹變圓,偽足和突起減少。50mW/cm2微波輻射后即刻SAN細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]升高(P<0.05),細(xì)胞膜表面可見穿孔現(xiàn)象。
　　(8)微波輻射致體外培養(yǎng)SAN細(xì)胞損傷后HCN4表達(dá)改變:50mW/cm2微波輻射后即刻,SAN細(xì)胞中HCN4蛋白表達(dá)顯著減弱(P

12、<0.01),12h表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)成年大鼠SAN特殊的位置提示:大鼠SAN取材時(shí)一定要保留上腔靜脈近心段;兩步法前固定取材有助于大鼠SAN電鏡標(biāo)本的制作。
　　(2)10、50mW/cm2微波輻射導(dǎo)致大鼠SAN功能障礙、組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)損傷,上述改變與微波輻射劑量呈正相關(guān)。
　　(3)10、50mW/cm2微波輻射可導(dǎo)致培養(yǎng)的SAN細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷和搏動(dòng)下降,且與微波輻射