骨髓衍生肝干細胞移植逆轉小鼠肝纖維化的實驗研究.pdf

1、干細胞是近幾年生命科學技術發(fā)展領域的研究熱點。自1999年以來，干細胞的研究與應用多次入選美國《Science》公布的年度世界十大科技成果。干細胞是一類未分化的細胞或原始細胞，是人體及各種組織細胞的最初來源，具有高度自我更新和多向分化潛能及可植入性、可重建性等特征。這些細胞可以通過細胞分裂維持自身細胞群的數(shù)量，又可以進一步分化成為各種組織細胞，構成機體各種復雜的組織器官，實現(xiàn)機體內部建構和自我康復。目前根據(jù)干細胞的功能可將干細胞分為全能

2、干細胞(如胚胎干細胞，可以分化為機體所有組織細胞)、多能干細胞(具有多向分化潛能，可以分化為多種組織細胞，如骨髓造血干細胞、間充質干細胞等)和專能干細胞(維持某一特定組織細胞的單一方向自我更新，如腸上皮干細胞等)。也可根據(jù)干細胞的來源分為：來源于胚胎組織的干細胞--胚胎干細胞；來源于成人組織器官的干細胞--成體干細胞。根據(jù)表面抗原、轉移因子、蛋白質表達等不同，也可將干細胞具體分類。由于受到倫理、取材等的限制，目前干細胞研究領域中最受重視

3、的是對骨髓中的干細胞的研究，近幾年來，越來越多的證據(jù)表明骨髓干細胞是一群高度異質的細胞群，包含多種類型的干細胞，因而骨髓干細胞在一定條件下可以分化形成多種造血外組織細胞，如成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、成肌細胞和肝細胞及神經(jīng)膠質細胞等。通常把可以分化形成肝細胞的骨髓干細胞稱之為骨髓衍生肝干細胞，借此與其他來源的肝干細胞相區(qū)別。 目前發(fā)現(xiàn)有三種類型的細胞參與成體肝臟的更新與修復，第一類是分化成熟肝細胞。在肝臟輕度受損時，成熟肝細

4、胞經(jīng)過1～2次有絲分裂，使肝臟體積與功能得以恢復，這種修復能力極為有限。第二類是來自終末小膽管Hering管的肝卵圓細胞。在肝臟嚴重受損時，卵圓細胞大量增殖并分化為肝細胞與膽管上皮細胞，從而使肝臟修復，這屬于短期增殖細胞，其修復能力有一定限度，它常需補充。第三類細胞是循環(huán)源于骨髓中的干細胞，其中的骨髓衍生肝干細胞，雖然它們數(shù)量非常少，但卻具有強大的自我更新能力，能夠不斷地釋放入血液循環(huán)，最后至肝臟，并可以定向或橫向分化為肝細胞或肝臟前體

5、細胞。 慢性肝臟疾病以肝細胞變性、壞死、纖維化為主要病變，一旦肝纖維化形成，嚴重影響肝臟功能和患者的生活質量。眾所周知，目前對于各種終末期肝病，促進肝臟細胞再生和抗纖維化是治療肝臟疾病的關鍵。肝移植作為治療急、慢性肝衰竭的有效手段，但由于供肝缺乏、費用昂貴、免疫排斥等問題，使其臨床應用嚴重受限，臨床上主要采取基礎療法和對癥治療。近年來干細胞技術的不斷突破及干細胞本身所具有的特性，尤其認識到骨髓衍生肝細胞具有與胚胎干細胞一樣強的分

6、化潛能，能分化形成肝細胞，為終末期肝臟疾病的治療提供了一條嶄新的途徑。這些骨髓源性肝干細胞還能有效地糾正細胞代謝缺陷，并且在一些動物模型研究中顯示移植細胞具有明顯的存活優(yōu)勢。另外與其他干細胞如胚胎干細胞相比，骨髓源性干細胞更容易提取、分離、純化，能更好地解決肝干細胞體外培養(yǎng)與擴增問題。利用骨髓肝干細胞具有的強大增殖能力，采用細胞移植來修復與治療受損或病變的肝臟組織，將是一種理想的治療方法。 骨髓中含有大量不同類型和不同發(fā)育階段的

7、干細胞群，它們在形態(tài)上都表現(xiàn)為淋巴細胞樣細胞的單個核母細胞。根據(jù)細胞表面的標志物和分化潛能，可進一步把骨髓干細胞區(qū)分為不同的干細胞群，如：CD34+，c-kit+，Sca-1+，Thy-1+等干細胞系，均能在一定條件下分化形成肝細胞，但到底上述報道的特定標記骨髓干細胞群中究竟哪種細胞群轉化為肝臟細胞效果最佳及潛力最大?我們從分選的骨髓Thy1.1+lin-，CD34+lin-，Sca-1+lin-，c-Kit+lin-四種干細胞群篩選并

8、證實，骨髓中Lin-C-kit+干細胞群形成肝細胞的潛能最佳，是一群富含骨髓衍生肝干細胞的細胞群。 本實驗利用四氯化碳(CCl4)以及酒精分別建立雌性小鼠的慢性肝損傷模型，分選出雄性小鼠骨髓c-Kitlin-細胞，并將其移植入模型小鼠體內，通過肝臟形態(tài)學、組織學變化及肝功能等指標評價移植c-Kit+lin-細胞修復肝損傷的效果；利用小鼠的Y染色體性別決定區(qū)域DNA(Sry)和白蛋白的mRNA為標記，通過原位雜交檢測受體肝臟中存在

9、的雙陽性細胞及其數(shù)量，以此評價移植干細胞在肝內歸巢、分布及分化情況，為將來臨床上應用骨髓衍生肝干細胞肝內移植治療肝疾病奠定基礎。 [材料和方法]： 1.模型小鼠的建立取6～8周齡的SPF級純系BALB/C雌性小鼠，質量均為18-20g。 1.1四氯化碳性肝損傷每5天皮下注射40％四氯化碳(四氯化碳與花生油以4：6的體積比混合)，4.5ml/kg，共16周。 1.2酒精性肝損傷給予54度白酒每天灌胃2次共1

10、6周，同時飲用10％(v/v)白酒飲料。第1周～第3周末灌胃量為每次8mL/kg，第4周～第7周末灌胃量為每次10mL/kg，第8周～第16周末灌胃量為每次12mL/kg。 2.小鼠骨髓C-Kit+lin-細胞分離和檢測 2.1免疫活性細胞磁珠分選法(MagneticactivatedcellseparationMACS)分離骨髓衍生肝干細胞取6～8周SPF級BALB/c雄系性小鼠，利用骨髓衍生肝干細胞抗原表面標記，采用

11、MACS方法分離C-Kit+lin-細胞。 2.2流式細胞儀檢測細胞純度。 先用PE標記細胞群，將分離前細胞群和分離后細胞群進行比較，可檢測細胞標記在分選前后的純度情況及一抗和抗體磁珠結合情況。 3.同種同品系肝內移植骨髓肝干細胞 3.1肝內移植移植前，將分離好的供體雄性小鼠骨髓衍生肝干細胞進行計數(shù)，離心8℃條件，10min，×1500rmp。棄上清，加入Buffer22.5ml重懸細胞。調節(jié)細胞濃度1×

12、106個/ml，移植組每只予100μl細胞懸液尾靜脈注射。對照組僅予以注射Buffer2(PBS，PH7.2+0.5％BSA+2mMEDTA)100μl。 3.2細胞移植后的肝功能檢測分別于移植30天后實驗組和對照組活殺小鼠取血清，測量血清中ALT、AST和ALB等肝功能指標。 3.3肝組織常規(guī)病理檢查解剖小鼠完整取出肝臟組織，脫水，石蠟包埋，按標準操作行HE、VG染色，光鏡下觀察結果。 3.4原位雜交檢查切片防

13、脫RNA處理。設計制備并運用小鼠Y染色體Sry基因的cDNA探針以及白蛋白mRNA探針，按原位雜交方法操作，熒光顯微鏡下觀察結果。 在同一切片上先行白蛋白mRNA原位雜交，雜交后滴加Y染色體Sry基因的DNA探針。在熒光顯微鏡下激發(fā)各自波長，分別照相，并進行圖象融合以獲得雙陽性細胞圖像。 3.5骨髓衍生肝干細胞肝內增殖情況比較每張切片隨機選取10個視野，記錄雙陽性細胞率。每組取8張切片計數(shù)，了解移植細胞肝內轉化情況。

14、 4.統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)用-X±S表示。應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學處理。所有數(shù)據(jù)采用單向量方差分析(One-wayANOVA)、秩和檢驗(Kruskal-WallisH)和兩獨立樣本t檢驗(Independend-SamplesTTest)分析。P≤0.05表示差別有統(tǒng)計學意義。 [結果]： 1.16周后酒精性肝損傷模型小鼠肝功能檢查提示ALT、AST升高，ALB下降，HE、VG染色病理切片可

15、見肝細胞變性、壞死、炎細胞浸潤、膠原纖維增生等改變。 2.16周后四氯化碳性肝損傷模型小鼠肝功能檢查提示ALT、AST顯著升高，ALB降，HE、VG染色病理切片可見肝細胞片狀壞死、炎細胞浸潤、膠原纖維大量增生等改變。 3.移植30天后移植c-Kit+lin-細胞組肝功能有明顯恢復，指標接近正常；對照組無明顯變化。 4.移植30天后，HE以及VG染色病理切片發(fā)現(xiàn)移植干細胞組肝組織少有肝纖維化，對照組肝臟纖維化較明顯

16、。 5.Y染色體Sry基因DNA以及白蛋白mRNA雙重原位雜交結果表明：移植組可見移植細胞在肝內定居并轉化成有功能的肝細胞。 [結論]： 1.皮下注射四氯化碳以及酒精灌胃可導致小鼠慢性肝損傷，于16周后可見肝臟存在纖維化的表現(xiàn)。 2.MACS分離c-Kit+lin-細胞純度均達到84％，回收率達到80％以上。 3.將小鼠骨髓c-Kit+lin-細胞移植后，可明顯改善肝損傷小鼠的肝功能，逆轉肝纖維化