乏氧對牙周膜細(xì)胞RANKL-OPG系統(tǒng)表達(dá)的影響.pdf

1、目的
　　 牙周病、糖尿病、心血管疾病和正畸治療等許多因素均可以導(dǎo)致人體局部組織的血液循環(huán)障礙。當(dāng)牙周組織處于炎癥狀態(tài)下，局部微循環(huán)障礙，牙周組織乏氧明顯。組織乏氧以及炎癥細(xì)胞因子都可以活化核因子κb受體活化因子配基(receptoractivatorofNF-κBligand,RANKL)，它能與位于破骨細(xì)胞表面唯一的受體-核因子-κB受體活化因子(receptororactivatorofnuclearfactor-κB，R

2、ANK)相結(jié)合，通過一系列酶促級聯(lián)反應(yīng)引起破骨細(xì)胞的活化和成熟。骨保護(hù)素(osteoprogeterin，OPG)為腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)受體超家族成員，屬于一種溶性的糖蛋白，是RANKL的天然誘飼受體。OPG能競爭性地與RANKL結(jié)合，從而阻斷RANK與RANKL間的相互作用，抑制破骨細(xì)胞的活化和成熟。
　　 牙周病是一類侵犯牙齦和牙周支持組織的慢性炎癥性破壞性疾病，在乏氧微環(huán)境和局部炎

3、癥細(xì)胞因子的作用下，牙周組織周圍環(huán)境和牙周組織細(xì)胞代謝發(fā)生改變。在全身因素和局部因素的調(diào)控下，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞作用失衡，骨吸收大于骨喪失。本實(shí)驗(yàn)旨在體外乏氧環(huán)境下培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，模擬相當(dāng)于牙周膜組織局部缺氧的病理模型。探討不同氧張力對牙周膜細(xì)胞RANKL/OPG系統(tǒng)表達(dá)的影響，運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附法檢測牙周膜細(xì)胞在乏氧和常氧環(huán)境下RANKLmRNA和OPGmRNA及蛋白的表達(dá)。研究乏氧對牙周膜細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，為

4、進(jìn)一步研究乏氧對牙周病理變化及組織再生奠定理論基礎(chǔ)。
　　 方法
　　 人牙周膜細(xì)胞取自11～18歲兒童因正畸原因拔除的健康前磨牙，牙根已發(fā)育完成，刮取其根中1/3牙周膜組織，常規(guī)組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)。待細(xì)胞增殖達(dá)匯合點(diǎn)后行細(xì)胞傳代，取第5～7代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　 1.實(shí)驗(yàn)分組
　　 乏氧組:牙周膜細(xì)胞分四組在1％O2、5％CO2、94％N2的37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6h、12h、24h和48h。對照組（常氧

5、組）:牙周膜細(xì)胞分四組在20％O2、5％CO2、75％N2的37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6h、12h、24h和48h。
　　 2.將牙周膜細(xì)胞以密度為1×106個/ml接種于六孔板中，按上述實(shí)驗(yàn)分組分別移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，Trizol兩步法分別提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測RANKLmRNA和OPGmRNA的表達(dá)情況。
　　 3.將牙周膜細(xì)胞以密度為1×106個/ml接種于六孔板中，按上述實(shí)驗(yàn)分

6、組移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h、24h、48h，收集條件培養(yǎng)液，-80℃保存，酶聯(lián)免疫吸附法檢測OPG蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 1.乏氧組6h、12h、24h、48h組牙周膜細(xì)胞RANKLmRNA的表達(dá)明顯高于對照組，乏氧6h組與對照組相比差別不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，乏氧12h、24h、48h組與對照組相比RANKLmRNA的表達(dá)升高，且有時間依賴性，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.乏氧6

7、h、12h、24h、48h組牙周膜細(xì)胞OPGmRNA的表達(dá)明顯低于對照組，隨乏氧時間延長，OPGmRNA的表達(dá)下降，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測乏氧條件下12h、24h、48h人牙周膜細(xì)胞培養(yǎng)液中OPG濃度明顯低于對照組，隨乏氧時間的延長OPG降低，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　 乏氧培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞RANKLmRNA表達(dá)升高，提示乏氧使牙周膜細(xì)胞R