克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)對銅脅迫的免疫響應(yīng)研究.pdf

1、近年來，隨著工、農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，我國水域重金屬污染日趨嚴(yán)重，給水生生物的生存和繁衍造成了嚴(yán)重的威脅?！吨袊鴿O業(yè)生態(tài)環(huán)境狀況公報》指出我國近岸海域、江河、湖泊的漁業(yè)水域中，Cu2+的污染超標(biāo)程度仍在增加（《中華人名共和國漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定Cu2+≤0.01mg/L）。Cu是甲殼動物體內(nèi)必需的微量營養(yǎng)素，不僅是酚氧化酶、超氧化物歧化酶活性中心的重要因子，也是合成血藍(lán)蛋白的必需成分，但是高濃度的銅亦會對生物體會產(chǎn)生毒害作用。研究表明，生活在富

2、含各種病原體和脅迫因子水體中的甲殼動物，在進(jìn)化過程中已演替出了一套具有強(qiáng)抗逆性的免疫系統(tǒng)來適應(yīng)或抵抗環(huán)境的脅迫。因此，開展水體銅污染的研究具有重要的意義。
　　克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、螯蝦科（Cambaridae），俗稱小龍蝦，具有分布廣、抗逆性強(qiáng)、對環(huán)境條件要求低等特點(diǎn)，近年來被廣泛應(yīng)用于甲殼動物免疫學(xué)研究以及指示環(huán)境污染的模式實(shí)驗(yàn)動物。

3、免疫指標(biāo)與蝦類的生理狀態(tài)、機(jī)體代謝、營養(yǎng)狀況及疾病有著密切的關(guān)系，尤其當(dāng)蝦類受到外界因子的影響而發(fā)生生理或病理變化時，必定會在免疫指標(biāo)中反映出來。因此，研究重金屬對克氏原螯蝦的影響，檢測免疫相關(guān)指標(biāo)的變化是最為直接和有效的。本研究以克氏原螯蝦為研究對象，利用免疫學(xué)、毒理學(xué)和病理學(xué)相結(jié)合的方法，通過檢測不同濃度Cu2+對螯蝦主要免疫因子以及對免疫器官的影響，旨在為利用免疫學(xué)方法監(jiān)測水環(huán)境的早期污染提供理論依據(jù)，同時也豐富了甲殼動物免疫學(xué)的

4、理論。研究結(jié)果與結(jié)論如下:
　　1水體Cu2+在克氏原螯蝦體內(nèi)的積累與分布
　　本課題通過測定克氏原螯蝦半致死濃度，并參考《中國漁業(yè)生態(tài)環(huán)境狀況公報》以及國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上設(shè)定Cu2+質(zhì)量濃度梯度。采用單因子梯度試驗(yàn)，通過在外源水環(huán)境中添加0.0、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0mg/L的Cu2+，并分別于24 h，48h，72 h和96 h測定其在克氏原螯蝦肝胰腺、鰓和肌肉中的積累狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:三種組

5、織中的Cu2+積累量隨著水環(huán)境中Cu2+濃度的升高以及誘導(dǎo)時間的延長而增加，即銅積累具有明顯的時間-效應(yīng)與劑量-效應(yīng)關(guān)系;本研究還發(fā)現(xiàn)Cu2+蓄積具有明顯的組織差異性即鰓＞肝胰腺＞肌肉，可能與Cu2+濃度較高和誘導(dǎo)時間較短有關(guān)。銅在鰓、肝胰腺和肌肉中積累量最高值分別為22.57μg/g、11.84μ g/g、1.56μg/g，隨著Cu2+濃度的升高，肝胰腺中Cu蓄積速度最快，鰓次之，肌肉最慢。因此，高Cu2+環(huán)境中，肝胰腺是銅積累的主要

6、場所，在銅代謝過程中發(fā)揮著主要的作用。2水體Cu2+對克氏原螯蝦細(xì)胞免疫因子的影響
　　研究發(fā)現(xiàn)，螯蝦的血細(xì)胞分為三種類型:透明細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞、大顆粒細(xì)胞，經(jīng)Giemsa染色液染色后發(fā)現(xiàn)無顆粒細(xì)胞呈藍(lán)色，細(xì)胞核染色較深，小顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞中的顆粒呈紅色，核亦呈藍(lán)色，但經(jīng)Cu2+暴露后，各處理組均未觀察到血細(xì)胞形態(tài)的明顯變化;染毒96 h內(nèi)各濃度梯度組的血細(xì)胞數(shù)均低于對照組，但隨著染毒時間的延長及Cu2+濃度的升高血細(xì)胞數(shù)量的

7、變化無明顯的規(guī)律性，這可能與個體差異有關(guān);螯蝦血細(xì)胞對金黃色葡萄球菌的吞噬活性和吞噬指數(shù)變化趨勢相似，隨著銅離子濃度的升高和染毒時間的延長，吞噬活性(PP)和吞噬指數(shù)(PI)均逐漸降低。0.5 mg/L處理組PP在染毒初期顯著升高，整個試驗(yàn)期間，3.0、5.0和10.0 mg/L濃度組血細(xì)胞的PP和PI顯著低于對照組(P＜0.05)。結(jié)果表明，低濃度的Cu2+在短期內(nèi)能提升螯蝦的免疫力，低濃度Cu2+長時間作用或高濃度的Cu2+能使螯蝦

8、的免疫力降低，對病原微生物的易感性提高。
　　3 Cu2+脅迫對克氏原螯蝦血清、組織和器官中免疫相關(guān)酶活性的影響
　　本研究測定了不同濃度Cu2+脅迫下螯蝦血清中酚氧化酶(PO)、抗菌活力(Ua)、溶菌活力(Ub)以及血清、肝胰腺和鰓中超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)的含量變化。結(jié)果表明:與對照組相比，1.0、3.0、5.0和10.0 mg/L組在染毒48h后Ub活力顯著

9、下降（P＜0.05）;染毒72h后，血清Ua活力顯著下降(P＜0.05);血清中PO活性的變化存在時間-劑量的效應(yīng)關(guān)系，96h后各處理組均顯著降低（P＜0.05）;低濃度Cu2+(0.5mg/L)誘導(dǎo)后在較短時間內(nèi)對螯蝦血清、肝胰腺和鰓中SOD和CAT均具有激活作用，隨著時間的延長則表現(xiàn)出抑制效應(yīng)，而高濃度Cu2+處理均表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，差異顯著(P＜0.05)且肝胰腺中兩種酶活力均高于鰓;螯蝦肝胰腺中MDA活力的變化較鰓和血清中顯著，低

10、濃度Cu2+誘導(dǎo)后在較短時間內(nèi)螯蝦MDA活性低于對照組，隨著時間的延長及Cu2+濃度的升高M(jìn)DA活性出現(xiàn)升高的趨勢，且MDA活力的變化與SOD活力變化呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性，所以利用螯蝦的免疫系統(tǒng)預(yù)測水環(huán)境重金屬污染具有現(xiàn)實(shí)和理論意義。
　　4水體Cu2+對克氏原螯蝦肝胰腺顯微結(jié)構(gòu)的影響
　　Cu2+脅迫下，克氏原螯蝦肝小管明顯增厚，單層柱狀細(xì)胞腫大，管腔變細(xì)，肝小管基膜出現(xiàn)波紋狀拱起;血竇腔中的血細(xì)胞數(shù)量明顯增多，并且在肝小管基膜

11、斷裂處與柱狀上皮細(xì)胞充擠在一起;5.0 mg/L Cu2+濃度脅迫后部分柱狀細(xì)胞已變性，基膜與柱狀細(xì)胞之間出現(xiàn)空泡;10.0 mg/L Cu2+濃度脅迫后，單層柱狀細(xì)胞變性甚至解體，在管腔中出現(xiàn)細(xì)胞碎片，肝胰腺中血細(xì)胞增多，基膜與單層柱狀細(xì)胞之間出現(xiàn)巨大的空泡。本研究結(jié)果顯示高濃度Cu2+對克氏原螯蝦肝胰腺的顯微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的損傷。
　　綜上所述，克氏原螯蝦對銅脅迫的免疫應(yīng)答機(jī)制可能是水體Cu2+主要通過鰓吸收進(jìn)入血淋巴，最終主要

12、在鰓和肝胰腺中積累;當(dāng)Cu2+隨著血淋巴循環(huán)到達(dá)全身各處時，首先對機(jī)體的相關(guān)免疫指標(biāo)產(chǎn)生了影響，然后才對組織器官和個體產(chǎn)生影響。由于各種免疫因子的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能不同，其活性變化受Cu2+脅迫程度也各有差異，因此綜合利用螯蝦的各種免疫指標(biāo)來監(jiān)測水體環(huán)境中Cu2+污染的程度具有可行性;隨著Cu2+濃度的升高，克氏原螯蝦的肝胰腺組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了不可逆性的病理變化，進(jìn)而影響到螯蝦的生長甚至導(dǎo)致其死亡，更能反映出銅污染程度大小。
　　本研究