Bim、p-AKT蛋白在乳腺癌癌變中的表達(dá)及意義.pdf

1、Bim(Bcl-2 interacting mediator of cell death)是Bcl-2家族中僅含有一個BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白，具有助凋亡活性，廣泛分布在機(jī)體各種組織，對防御自身免疫、維持造血細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有重要意義，并具有腫瘤抑制因子活性。不同的細(xì)胞Bim表達(dá)和功能的調(diào)節(jié)方式各異，包括轉(zhuǎn)錄水平、亞細(xì)胞定位、磷酸化調(diào)節(jié)等。Bim轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控十分復(fù)雜，可受到多種信號途徑的調(diào)節(jié)，已報道的有MLK/JNK，PI3K/AKT以及RAS/MA

2、PK途徑?，F(xiàn)有許多研究表明PI3K/Akt信號通路異常，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。 本教研組的前期工作發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt-Bad通路在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用，Bim、Bad同屬于BH3-only亞家族，那么在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中，Bim是否扮演著同樣重要的角色，這對指導(dǎo)乳腺癌的臨床診斷和治療有重要意義。 材料和方法： 1、材料： 人乳腺正常上皮細(xì)胞系MCF-10A、及人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、

3、MDA-MB-231及MDA-MB-435S，30例新鮮乳腺癌組織及30例癌旁新鮮乳腺組織，101例乳腺組織取自于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2001年1月至2007年5月手術(shù)切除標(biāo)本。 2、主要試劑： 兔抗人Bim多克隆抗體，兔抗人p-Akt1/2/3(Ser473)多克隆抗體，PI3K/AKT特異性抑制劑LY294002均購自Cell Signaling公司。Western Blotting用二抗、兔抗人多克隆anti-

4、β-actin抗體(PR-0255)、熒光二抗、HEST均購自中山生物技術(shù)有限公司。RNA抽提試劑盒Trizol購自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司，引物序列合成由TaKaRa公司完成。 3、方法： (1)免疫熒光方法檢測Bim在正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A及人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231及MDA-MB-435S中的表達(dá)。 (2)免疫組織化學(xué)(S-P)法檢測B

5、im蛋白在乳腺各組病變組織中的表達(dá)。 (3)Western Blotting，RT-PCR分別檢測Bim蛋白及Bim mRNA在正常乳腺上皮細(xì)胞系及三種乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)。 (4) Western Blotting檢測乳腺癌與癌旁乳腺組織中Bim、p-Akt蛋白的表達(dá)。 (5) Western Blotting檢測用LY294002阻斷PI3K/AKT信號通路后乳腺癌細(xì)胞中Bim和P-AKT蛋白表達(dá)的變化。

6、 (6)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對Western Blotting及RT-PCR圖像灰度值進(jìn)行t檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，確定p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、免疫熒光方法結(jié)果顯示Bim是一種漿表達(dá)蛋白。在正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A、及人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435S中都呈陽性表達(dá)。 2、正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A中Bim蛋白及Bim mRNA

7、的表達(dá)均高于MCF-7、MDA-MB-231及MDA-MB-435S三種乳腺癌細(xì)胞系，p值分別p=0.003及p=0.009。 3、Bim蛋白在乳腺導(dǎo)管內(nèi)增生性病變及浸潤性導(dǎo)管癌組織中陽性表達(dá)率逐漸降低，在乳腺普通導(dǎo)管增生與乳腺導(dǎo)管重度不典型及原位癌組間、重度不典型及原位癌和浸潤性導(dǎo)管癌組間陽性表達(dá)率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( p=0.026；p=0.014)。Bim蛋白表達(dá)與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系，但與組織學(xué)分級有關(guān)

8、(p=0.033)，且組織學(xué)分級越低，Bim蛋白陽性表達(dá)率越低。 4、Bim和p-Akt在30例乳腺癌組織和癌旁正常組織中均有不同程度的表達(dá)。其中Bim蛋白在癌組織中的表達(dá)明顯低于對應(yīng)的正常乳腺組織，平均灰度值分別是0.322±0.138和0.591±0.130(p=0.001)。p-Akt蛋白在癌組織中的表達(dá)明顯高于對應(yīng)正常乳腺組織，平均灰度值分別是0.710±0.219和0.412±0.115(p=0.002)。兩種蛋白在乳

9、腺癌組織中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.489 p=0.039)。 5、將不同濃度的LY294002(0、10、25、50μmol/L)加入培養(yǎng)液后24h，用Western Blotting檢測顯示，乳腺癌細(xì)胞MCF-7中p-Akt蛋白水平下降，Bim蛋白表達(dá)水平升高(p<0.05)。 結(jié)論： 1、正常乳腺上皮細(xì)胞系Bim蛋白及Bim mRNA的表達(dá)均高于乳腺癌細(xì)胞系。 2、Bim蛋白的表達(dá)在乳腺癌癌變過程中