鐵還原微生物的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析.pdf

1、細(xì)菌的異化Fe(Ⅲ)還原是生物進(jìn)化過(guò)程中最早出現(xiàn)的生物能量代謝途徑，多種古細(xì)菌和真細(xì)菌具有還原Fe(Ⅲ)的能力。厭氧條件下環(huán)境中的Fe(Ⅲ)氧化物發(fā)生還原，并且這一過(guò)程主要是微生物介導(dǎo)的異化還原，即微生物以Fe(Ⅲ)氧化物為最終電子受體的厭氧呼吸過(guò)程。在自然界中只要存在厭氧環(huán)境，幾乎都會(huì)發(fā)生異化Fe(Ⅲ)還原現(xiàn)象，并發(fā)現(xiàn)有異化鐵還原微生物存在。異化Fe(Ⅲ)還原被認(rèn)為是地球上最早的呼吸形式之一，在生命的進(jìn)化歷程中這一遺傳烙印在一定范圍和

2、一定程度上都會(huì)被繼承，且勢(shì)必有更多的微生物種類都具有還原Fe(Ⅲ)的能力或潛能。因此，加強(qiáng)異化Fe(Ⅲ)還原研究對(duì)于揭示地球早期生命的能量代謝特征和生命進(jìn)化具有重要的理論意義。水稻土作為一種研究氧化還原過(guò)程的模式系統(tǒng)一直受到人們的重視，其中鐵的氧化還原占有重要地位。因而系統(tǒng)開(kāi)展Fe(Ⅲ)還原微生物特性的研究，對(duì)于闡明土壤中氧化鐵的微生物還原機(jī)理、認(rèn)識(shí)異化鐵還原在稻田生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用，促進(jìn)水稻土中污染物的轉(zhuǎn)化與修復(fù)具有重要的理論和實(shí)際

3、意義。 本文通過(guò)對(duì)采自四川和江西兩地的典型水稻土樣品的厭氧富集培養(yǎng)試驗(yàn)，初步確立了從水稻土中分離純化鐵還原微生物的方法。進(jìn)一步對(duì)分離純化得到的一些菌株進(jìn)行菌體菌落形態(tài)特征和生理特征鑒定和鐵還原菌利用不同碳源時(shí)的Fe(Ⅲ)還原特征比較，通過(guò)對(duì)鐵還原菌株的16S rDNA序列分析，以便確定其在系統(tǒng)發(fā)育分類中的地位。試驗(yàn)得出以下主要結(jié)論： (1)采用富集培養(yǎng)方法，從四川水稻土中分離得到四株鐵還原菌P4、8<,13>、8<,18

4、>和8<,19>，從江西水稻土中分離得到三株鐵還原菌4<,03>、4<,10>和4<,20>。這7個(gè)菌株在菌體菌落形態(tài)和生理特征上表現(xiàn)出一定的共性。其菌落特征為：菌落較小，白色，隆起，規(guī)則圓，不透明，表面光滑，直徑3mm左右。染色結(jié)果表明，這7株菌為革蘭氏陽(yáng)性，桿狀，圓末端。通過(guò)生長(zhǎng)曲線測(cè)定，這7株菌在培養(yǎng)的10～25 h之間達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。由此可知，在30℃培養(yǎng)條件下用50％LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)繁1d即可達(dá)到菌株的快速生長(zhǎng)的要求。

5、 (2)通過(guò)將三代鐵還原菌接種于氫氧化鐵液體培養(yǎng)基中，以三代菌體的Fe(Ⅲ)的還原率對(duì)這7個(gè)菌株的鐵還原穩(wěn)定性進(jìn)行考察，7個(gè)菌株的Fe(Ⅲ)的還原率均在70％～90％之間，說(shuō)明這7株菌體的鐵還原能力比較穩(wěn)定。 (3)為了能更加準(zhǔn)確地反映不同菌株在利用不同碳源時(shí)對(duì)Fe(OH)<,3>還原的影響，通過(guò)比較菌株P(guān)4在利用9.6 mmol/L和60 mmol/L 2種濃度碳源時(shí)對(duì)Fe(OH)<,3>還原的影響及其鐵還原特征分析得出，選用

6、60 mmol/L碳源濃度能較好的對(duì)不同鐵還原微生物進(jìn)行鐵還原功能強(qiáng)弱的初步劃分。 (4)不同碳源利用試驗(yàn)表明，葡萄糖和丙酮酸鈉可作為這7個(gè)菌株的優(yōu)勢(shì)碳源。這7個(gè)菌株在利用葡萄糖時(shí)的Fe(Ⅲ)還原量最大，反應(yīng)速率(V)最高。不同菌株利用葡萄糖的Fe(Ⅲ)還原最大潛勢(shì)大小順序?yàn)椋壕?<,18>>4<,20>>4<,03>>8<,13>>P4>4<,10>>8<,19>。由計(jì)算出的鐵還原率比較可知，菌株8<,18>的Fe

7、(Ⅲ)還原率最高，高達(dá)92.11％，最低的菌株8<,19>只有24.52％。整個(gè)體系在添加葡萄糖、丙酮酸鈉培養(yǎng)初期的pH迅速下降至最低點(diǎn)4.5～5.5之間，隨后緩慢回升至6.5左右。而添加其他碳源時(shí)鐵還原進(jìn)行的緩慢，pH始終維持在7.0～7.5左右?？梢?jiàn)在微生物正常生長(zhǎng)的pH范圍內(nèi)，較低的pH利于Fe(Ⅲ)的還原。 (5)采用PCR技術(shù)獲得了1325 bp的鐵還原菌株P(guān)4的部分16S rDNA序列。經(jīng)NCBI的MegaBlast

8、同源性分析和利用Clustal和Phylip軟件構(gòu)建鐵還原菌株P(guān)4與相關(guān)菌株16S rDNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，可以看出鐵還原菌株P(guān)4與多種不可培養(yǎng)的厭氧菌株(DQ441334，DQ083720，DQ083732，AM176850，AY953222)均達(dá)到98％同源性，并且和多種丁酸梭狀芽孢桿菌株(AY604563，AM176850，DQ831126，X77834，AF005092)也有98％的同源性。因此可將菌株P(guān)4歸屬為厭氧丁酸梭狀芽胞桿