耐藥蛋白抑制劑維拉帕米治療難治性癲癇的實驗研究.pdf

1、研究背景： 癲癇是神經內科常見的疾病，是由于一側或兩側大腦半球神經元異常同步放電引起的短暫性腦功能障礙，盡管不斷有新的抗癲癇藥(antiepileptic drugs，AEDs)投入臨床應用，但仍有大約20％-30％的患者發(fā)展為難治性癲癇(refractory epilepsy，RE)。目前有關難治性癲癇耐藥性的機制尚不十分清楚。有研究顯示血腦屏障(blood—brain barrier，BBB)血管內皮細胞膜上存在多種藥物外向

2、轉運體，這些轉運體構成BBB的另一道屏障，與癲癇的多藥耐藥性相關。多藥轉運體是一些能與藥物結合并能將其轉運出細胞的蛋白，包括三磷酸腺苷結合盒(ABC)超家族成員如磷酸糖蛋白(P—glycoprotein，P—gp)、多藥耐藥相關蛋白、乳腺癌抗藥蛋白、大腦多藥抗藥蛋白和Ras超家族成員RL—IP76。生理條件下多藥轉運體作為外排泵，能夠主動將藥物泵出到血腦屏障以外，從而保護腦實質。因此多藥轉運體的表達和腦組織內藥物濃度降低成正比[10]，

3、P—gp是首先被發(fā)現(xiàn)的多藥耐藥蛋白質，它由多藥耐藥基因(multidrug resistant gene，MDR)編碼，病理情況下如癲癇發(fā)作的強度、時程、長期服用抗癲癇藥等都可以使P—gp表達上調，限制癲癇藥物進入腦組織，使患者腦內抗癲癇藥物濃度下降，這可能參與了難治性癲癇多藥耐藥的發(fā)生。因而改善耐藥性癲癇預后的方法就是針對耐藥性癲癇P—gp的過度表達，避免P—gp的外排作用、加強抗癲癇藥物的作用。目前有許多抑制P—gp的藥物逐漸被證實

4、，包括鈣通道阻滯劑、激素、蛋白激酶C抑制劑、免疫抑制劑、抗生素、表面活性劑等。但是這些研究多集中在對P—gp功能的影響，鑒于此，本課題擬建立慢性癲癇模型，給予P—gp抑制劑聯(lián)合常規(guī)抗癲癇藥物，研究P—gp抑制劑對難治性癲癇腦組織P—gp表達的影響，探討P—gp抑制劑的價值，為臨床難治性癲癇的治療提供新的方向。 目的：建立氯化鋰—匹羅卡品慢性癲癇模型，觀察P—gp抑制劑維拉帕米對難治性癲癇大鼠的腦電圖、自發(fā)性癲癇的發(fā)作頻率和程度、

5、大腦皮層及海馬組織P—gp表達的影響。 方法(1)建立氯化鋰—匹羅卡品慢性癲癇模型：雄性wistar大鼠50只，安裝大腦皮層電極，兩周之后，給予氯化鋰—匹羅卡品，誘發(fā)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)，終止發(fā)作后存活且狀態(tài)良好的大鼠出現(xiàn)自發(fā)性癲癇視為造模成功。(2)將造模成功的大鼠，經過耐藥性選擇后，分為生理鹽水組、匹羅卡品組、卡馬西平組、低劑量維拉帕米組、高劑量維拉帕米五個組。分別給予相應的藥物，觀察各組大鼠自發(fā)性癲癇的發(fā)作次數(shù)與發(fā)作級別，并記

6、錄各組大鼠在不同時期的腦電圖，取包括海馬在內的腦塊，通過免疫組化染色，圖像分析各組P—gp表達陽性面積率，半定量測定大鼠海馬組織及皮層P—gp的表達程度。 結果： (1)造模過程中，除生理鹽水組的6只大鼠之外，其余44只大鼠均誘發(fā)出癲癇持續(xù)狀態(tài)，存活且狀態(tài)良好者38只，出現(xiàn)自發(fā)性癲癇者32只。造模成功率為72.73％，行為學上表現(xiàn)為：出現(xiàn)以口咽自動癥為主的復雜部分發(fā)作，發(fā)展為強直陣攣發(fā)作，癲癇持續(xù)狀態(tài)一小時后給與安定中止

7、發(fā)作；兩天后進入靜止期，兩周左右發(fā)展為反復自發(fā)發(fā)作。 (2)慢性期卡馬西平組大鼠的自發(fā)性癲癇發(fā)作次數(shù)發(fā)作程度與匹羅卡品組比較無明顯差別(P＞0.05)，兩個維拉帕米組與前兩組比較大鼠的發(fā)作頻率明顯減少(P＜0.05)，發(fā)作程度明顯減輕(P＜0.05)。兩個維拉帕米劑量組之間比較差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。腦電圖示：匹羅卡品組、卡馬西平組出現(xiàn)陣發(fā)的多棘波，后者較前者波幅壓低，維拉帕米組散在出現(xiàn)單個棘波或尖波，且波幅明顯降低

8、。 (3)P—gp的表達結果：海馬P—gp的表達較皮層多(P＜0.05)，各組之間比較：與生理鹽水組相比，其他四組的P—gp的表達均增強，且四組之間陽性面積率從高到低依次是且卡馬西平組、模型組、兩個維拉帕米組，它們之間均有明顯差異(P＜0.05)，而維拉帕米兩個劑量組之間無明顯差異(P＞0.05)。 結論： (1)本實驗建立的匹羅卡品癲癇模型復制了人類顳葉癲癇復雜部分發(fā)作基本特征，是進行難治性癲癇研究的一個較為理