體外誘導(dǎo)BMP7基因修飾的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腎小管上皮樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察體外腎小管上皮細(xì)胞（Normal Rat Kidney Epithelial Cells）缺氧復(fù)氧損傷（Hypoxia-reoxygenation，H/R）微環(huán)境下慢病毒介導(dǎo)的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（human Bone Morphogenetic Protein-7，hBMP-7）轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Rat Bone Mesenchymal Stem Cells，rBMSCs）向腎小管樣上皮細(xì)胞分化的影響，初步探討以

2、BMSCs作為hBMP-7基因運(yùn)載細(xì)胞，hBMP-7和rMSCs聯(lián)合修復(fù)缺氧再灌注急性腎臟損傷的可行性。 方法：1、貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠乳鼠BMSCs，經(jīng)CD29、CD34、CD44、CD45鑒定BMSCs，并繪制不同代數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)和貼壁率曲線(xiàn)分析其生物學(xué)特性。選取生物活性良好的第三代（P3）、四代（P4）BMSCs作為轉(zhuǎn)染BMP7載體細(xì)胞；2、構(gòu)建編碼綠色熒光蛋白（GFP）的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白7慢病毒載體（Lv-hBMP

3、-7-GFP），體外轉(zhuǎn)染BMSCs后，MTT、Brdu標(biāo)記及流式細(xì)胞分析Lv-hBMP-7-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)BMSCs生物活性的影響；3、構(gòu)建大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）的缺氧復(fù)氧（H/R）模型，經(jīng)流式細(xì)胞分析檢測(cè)H/R后細(xì)胞凋亡情況，并在Transwell培養(yǎng)體系中與rMSCs共培養(yǎng)，分別于共培養(yǎng)后第3d、5d、7d收集細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞E-鈣粘蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，并經(jīng)免疫組化染色及流式細(xì)胞儀測(cè)定第

4、18型細(xì)胞角蛋白（Cytokeratin18，CK-18）的陽(yáng)性表達(dá)率。 結(jié)果：1、貼壁法可以簡(jiǎn)便提取原代BMSCs并進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)予以純化；2、構(gòu)建的Lv-hBMP-7-GFP可以高效轉(zhuǎn)染rMSCs，轉(zhuǎn)染效率約為70％，轉(zhuǎn)染后的rMSCs增殖活性無(wú)明顯改變（0.322±0.022，0.302±0.017，0.319±0.031，0.311±0.029）（P<0.05）并可以持續(xù)穩(wěn)定的分泌hBMP-7（5d后為0.329±0.

5、043）；3、H/RNRK-52E與各組rMSCs隨共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)E-cadherin和CK-18表達(dá)增加（37.22±0.21，36.54±0.32，38.37±0.38，47.02±0.31），與單純r(jià)MSCs培養(yǎng)組（2.43±0.18）、NRK-52E與rMSCs共培養(yǎng)組（8.52±0.27）、NRK-52E與轉(zhuǎn)染Lv-BMP-7的rMSCs共培養(yǎng)組（8.65±0.22）比較存在顯著性差異（P<0.01）；H/RNRK-52E與

6、轉(zhuǎn)染Lv-BMP-7的rMSCs共培養(yǎng)組（47.02±0.31）與其他實(shí)驗(yàn)組（H/RNRK-52E與rMSCs共培養(yǎng)組、H/RNRK-52E與轉(zhuǎn)染空病毒的rMSCs共培養(yǎng)組、H/RNRK-52E與BMP-7因子作用下的rMSCs共培養(yǎng)組）相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。 結(jié)論：體外大鼠腎小管上皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧微環(huán)境下rMSCs可以有效向腎小管上皮樣細(xì)胞分化，并且hBMP-7轉(zhuǎn)染可以促進(jìn)rMSCs的定向分化。研究結(jié)果可能為hBM