難治-復(fù)發(fā)急性髓系白血病線粒體ATP合酶β亞單位(ATPsyN-β)水平的變化及與白血病耐藥、預(yù)后關(guān)系的研究.pdf

1、研究背景：
　　急性髓細(xì)胞白血病(acute myelogenous leukemia，AML)是成年人最常見的急性白血病，目前它的治療仍以化療為主，但有70％左右獲得緩解的患者最終復(fù)發(fā)并演變?yōu)殡y治性白血病，導(dǎo)致治療失敗而死亡。臨床上導(dǎo)致白血病化療失敗最重要的原因是白血病細(xì)胞耐藥。有關(guān)白血病細(xì)胞耐藥的機(jī)制至今仍未完全闡明，因此尋找新的耐藥分子靶標(biāo)，對(duì)于提高急性髓細(xì)胞白血病的療效，改善其預(yù)后具有重要的臨床意義。
　　能量代謝是

2、腫瘤細(xì)胞代謝的中心環(huán)節(jié)，而線粒體成為近年來研究的熱點(diǎn)。分析特定類型腫瘤中線粒體相關(guān)基因和蛋白的變化并尋找其規(guī)律或許能為腫瘤患者的診斷和治療提供有意義的線索。線粒體ATP合酶是線粒體氧化磷酸化的限速酶，其β亞單位(ATPsyn-β)是ATP合酶中唯一起催化作用的亞基。有研究者觀察到在結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、腎癌等實(shí)體腫瘤細(xì)胞中線粒體ATPsyn-β表達(dá)下降，并且可能與腫瘤細(xì)胞的化療耐藥有關(guān)。
　　目前有關(guān)急性白血病線粒體

3、ATP酶的研究尚少。我們課題組在前期研究中對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)原代耐藥細(xì)胞及耐藥細(xì)胞株ATPsyn-β的表達(dá)研究顯示ATPsyn-β可作為一個(gè)獨(dú)立的耐藥相關(guān)蛋白參與調(diào)節(jié)CML急變患者的耐藥。
　　本研究旨在觀察急性髓細(xì)胞白血病患者白血病細(xì)胞中線粒體ATPsyn-β的表達(dá)及ATP酶活性的變化，并分析其與臨床療效、化療耐藥的關(guān)系，為急性白血病耐藥機(jī)制研究提供新的思路。<

4、br>　　第一章線粒體ATPsyn-β在急性髓系白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞及CD34+白血病細(xì)胞中的表達(dá)
　　目的:
　　檢測線粒體ATPsyn-β在不同急性髓系白血病患者中的表達(dá)，并分析其與AML患者耐藥的關(guān)系。
　　方法:
　　1.收集我院2010年10月～2012年6月期間急性髓系白血?。ǚ荕3型）住院患者骨髓標(biāo)本118例（包括初診患者38例，完全緩解患者38例，復(fù)發(fā)/難治患者42例），骨髓相對(duì)正常的非惡性血

5、液病門診患者骨髓標(biāo)本20例作為對(duì)照。采用熒光定量PCR、western印跡和流式細(xì)胞術(shù)檢測患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMCs)中線粒體ATPsyn-βmRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　2.用CD34正選免疫磁珠分選20例急性髓系白血病患者BMMCs，得到CD34陽性的白血病干/祖細(xì)胞，應(yīng)用熒光定量PCR、western印跡測定其ATPsyn-β水平。
　　3.用MTT法檢測急性髓系白血病患者（緩解患者38例，復(fù)發(fā)/難治患者42例）

6、BMMCs體外對(duì)阿霉素的敏感性，并分析線粒體ATPsyn-β表達(dá)水平與體外阿霉素耐藥性的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.非M3型急性髓系白血病患者(n=118) BMMCs中線粒體ATPsyn-β mRNA和蛋白水平較正常骨髓BMMCs呈顯著性降低，P＜0.01。
　　2.與AML緩解組(n=38)相比，復(fù)發(fā)難治組(n=42)骨髓BMMCs及CD34+細(xì)胞線粒體ATPsyn-β mRNA及蛋白水平均下降，P=0.004;且

7、兩組患者CD34+細(xì)胞中ATPsyn-β mRNA差異較BMMCs來源標(biāo)本更顯著，P=0.001。
　　3.阿霉素對(duì)復(fù)發(fā)/難治組和緩解組AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的IC50分別為13.690μM和1.549μM，前者為后者的8.84倍。
　　4.復(fù)發(fā)/難治組AML患者線粒體ATPsyn-β mRNA和蛋白表達(dá)水平與體外阿霉素對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞的IC50值呈顯著負(fù)相關(guān)，P＜0.05。
　　結(jié)論:
　　1.線粒體ATP合

8、酶β亞單位（ATPsyn-β）mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)在非M3型急性髓系白血病患者中較正常人明顯降低。
　　2.復(fù)發(fā)/難治急性髓系白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中線粒體ATPsyn-β mRNA及蛋白表達(dá)較緩解期患者下調(diào)。復(fù)發(fā)/難治急性髓系白血病患者CD34陽性細(xì)胞中ATPsyn-β表達(dá)低于緩解期患者。ATPsyn-β表達(dá)下調(diào)與骨髓單個(gè)核細(xì)胞體外對(duì)阿霉素的耐藥性存在負(fù)相關(guān)，提示ATPsyn-β與化療耐藥有關(guān)。
　　第二章難治/復(fù)發(fā)急性

9、髓系白血病原代細(xì)胞及耐藥白血病細(xì)胞株線粒體ATP酶活性變化及意義
　　目的:
　　測定不同急性髓系白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中線粒體ATP酶活性，并分析其臨床意義。
　　方法:
　　收集42例急性髓系白血?。ǚ荕3型）患者骨髓標(biāo)本并分離單個(gè)核細(xì)胞，提取BMMCs以及阿霉素耐藥細(xì)胞株（HL-60/ADM，K562/A02）的線粒體;利用ATP酶水解ATP生成ADP和Pi的原理，用酶標(biāo)方法測定Pi濃度，以間接反映線粒體

10、ATP酶的活性。
　　結(jié)果:
　　1、阿霉素耐藥細(xì)胞株HL-60/ADM、K562/A02的ATP酶活性(38.22±2.00U，36.70±7.47U)較其親本細(xì)胞株HL-60(132.06±14.65U)、K562(65.43±1.31U)呈顯著降低，P＜0.05。
　　2、復(fù)發(fā)/難治急性髓系白血病患者(n=26) BMMCs線粒體ATP酶平均活性為20.33U，低于緩解組患者(n=16)的31.17U，P＜0.0

11、5。ATP酶活性的高低與ATPsyn-β mRNA的表達(dá)量呈正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.阿霉素耐藥白血病細(xì)胞株HL-60/ADM、K562/A02存在ATP酶活性顯著下降;復(fù)發(fā)難治急性髓系白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞線粒體ATP酶活性顯著地低于緩解組病人，提示線粒體ATP酶活性下降與急性髓系白血病化療耐藥相關(guān)。
　　2.線粒體ATP酶活性與ATPsyn-β mRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)。
　　第三章線粒體ATPsyn

12、-β在急性髓系白血病耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和耐藥特性的影響
　　目的:探討ATPsyn-β對(duì)阿霉素誘導(dǎo)細(xì)胞增殖凋亡的影響，通過基因轉(zhuǎn)染、RNA干擾技術(shù)分析ATPsyn-β表達(dá)水平的變化與HL-60/ADM細(xì)胞耐藥習(xí)性產(chǎn)生及耐藥逆轉(zhuǎn)的關(guān)系。
　　方法:
　　1.采用熒光定量PCR、western印跡、流式細(xì)胞術(shù)檢測HL-60/ADM耐藥細(xì)胞株線粒體ATPsyn-β表達(dá)。
　　2.用RNA干擾技術(shù)抑制A

13、TPsyn-β表達(dá)后，MTT法檢測干擾前后阿霉素對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用;通過瑞氏-吉姆薩染色和Hoechst33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)的變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞對(duì)阿霉素的攝取以及細(xì)胞早期凋亡率。熒光定量PCR測定MRP的變化。
　　3.ATPsyn-β重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HL-60/ADM細(xì)胞株，MTT法檢測轉(zhuǎn)染前后阿霉素對(duì)HL-60/ADM細(xì)胞的增殖抑制作用;通過瑞氏-吉姆薩染色和Hoechst33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)的變化

14、;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞對(duì)阿霉素的攝取以及細(xì)胞早期凋亡率。熒光定量PCR測定MRPmRNA的變化。
　　結(jié)果:
　　1.HL-60/ADM耐藥細(xì)胞存在ATPsyn-β mRNA水平顯著降低，與親本非耐藥HL-60細(xì)胞相比，其mRNA水平下降了2.6倍，P＜0.01。HL-60/ADM細(xì)胞MRP mRNA表達(dá)水平較其親本的HL-60細(xì)胞增加了37倍。
　　2.HL-60/ADM耐藥細(xì)胞線粒體ATPsyn-β蛋白表達(dá)水平較其親

15、本HL-60細(xì)胞明顯下調(diào)，P＜0.05。
　　3.在RNA干擾實(shí)驗(yàn)，阿霉素對(duì)ATPsyn-β干擾組細(xì)胞的IC50為1.67±0.24μM，而未干擾組細(xì)胞的IC50為0.37±0.25μM，P＜0.05。在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，不論阿霉素處理細(xì)胞24小時(shí)還是48小時(shí)，與對(duì)照組細(xì)胞相比，ATPsyn-β轉(zhuǎn)染組IC50均顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.ATPsyn-β-siRNA可抑制HL-60細(xì)胞對(duì)阿霉素的攝取。阿霉素作用細(xì)胞1小

16、時(shí)后，與對(duì)照相比，同一時(shí)間點(diǎn)RNA干擾后的細(xì)胞攝取阿霉素?zé)晒怅栃月视酗@著下降。而ATPsyn-β重組質(zhì)?？纱龠M(jìn)HL-60/ADM細(xì)胞對(duì)阿霉素的攝取，阿霉素作用細(xì)胞4小時(shí)后，與對(duì)照相比，同一時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞內(nèi)阿霉素?zé)晒怅栃月拭黠@增加。
　　5.RNA干擾下調(diào)ATPsyn-β表達(dá)可抑制阿霉素誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞早期凋亡，而基因轉(zhuǎn)染上調(diào)ATPsyn-β表達(dá)可促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)的HL-60/ADM細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:
　　1.

17、HL-60/ADM耐藥細(xì)胞株中線粒體ATPsyn-β表達(dá)顯著低于其親本的HL-60細(xì)胞。
　　2.下調(diào)線粒體ATPsyn-β使HL-60細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性增加，并阻滯細(xì)胞凋亡;上調(diào)ATPsyn-β基因表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)HL-60/ADM細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥，促進(jìn)耐藥細(xì)胞的凋亡。
　　3.ATPsyn-β可影響HL-60及其耐藥細(xì)胞株MRP基因的表達(dá)。
　　第四章急性髓系白血病患者ATPsyn-β表達(dá)高低與預(yù)后分析
　　

18、目的:
　　總結(jié)118例急性髓系白血病患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。分析AML患者ATPsyn-β表達(dá)與療效的關(guān)系。
　　方法:
　　利用Kaplan-Meier生存分析、t檢驗(yàn)、Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)等對(duì)年齡、ECOG評(píng)分、白細(xì)胞計(jì)數(shù)與CR期、OS的關(guān)系進(jìn)行分析。分析ATPsyn-β表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1、118例AML患者，45歲以下組的平均緩解期和總生存期分別為16.06個(gè)月和25.

19、17個(gè)月，45歲以上組分別為9.49個(gè)月、16.98個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ECOG評(píng)分0-2級(jí)的患者生存狀況要好于3-4級(jí)者，P＜0.01。白細(xì)胞計(jì)數(shù)與OS呈顯著負(fù)相關(guān)。以30×109/L為切點(diǎn)，白細(xì)胞計(jì)數(shù)增高組預(yù)后較差，兩組的平均OS分別12.25個(gè)月和25.65個(gè)月，P＜0.05。
　　2、不同性別、年齡及體能狀態(tài)的患者ATPsyn-β的表達(dá)差異不顯著，ATPsyn-β的表達(dá)量與FAB分型關(guān)系不明顯。初診AML患者ATPsy

20、n-β低表達(dá)組的中位緩解期為4個(gè)月，而ATPsyn-β高表達(dá)組的中位緩解期為8個(gè)月，P＜0.05;截止末次隨訪日期，兩組在總生存期上無明顯差異。復(fù)發(fā)難治患者ATPsyn-β的表達(dá)高低與總生存期長短顯著相關(guān)，復(fù)發(fā)難治AML患者ATPsyn-β mRNA低表達(dá)者總生存期較短，為10.68±7.87個(gè)月，而高表達(dá)者為21.28±1.26個(gè)月，P＜0.05。
　　結(jié)論:
　　1、年齡、體能狀態(tài)、初診時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)高低是急性髓系白血病患