實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠早期腎臟病變的代謝組學(xué)研究.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分 實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型的建立和腎臟早期病變的鑒定 目的：建立實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠動(dòng)物模型,觀察其腎臟早期病變病程中不同時(shí)間點(diǎn)的病理生理特點(diǎn)及變化趨勢(shì),并對(duì)早期腎臟病變程度加以鑒定,為后期代謝組學(xué)研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?方法：1、健康SD大鼠84只,分為正常對(duì)照組36只,糖尿病模型組48只。腹腔注射STZ建立糖尿病模型,2次測(cè)定隨機(jī)血糖大于16.7mmol/L,定義為糖尿病大鼠。實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)

2、間為24周,分別于4、8、12、16、20及24周,留取血、尿、腎臟組織標(biāo)本。2、測(cè)定體重、血糖、24小時(shí)尿蛋白、血尿肌酐和腎臟重量,計(jì)算肌酐清除率及腎重/體重。3、腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察采用HE染色光鏡檢查。 結(jié)果：1、注射STZ 48-72小時(shí)后大鼠開(kāi)始出現(xiàn)多尿、多飲癥狀,并伴有活動(dòng)減少。2、糖尿病大鼠較正常對(duì)照組血糖明顯升高,尿量明顯增加,體重明顯減輕,在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組24小時(shí)尿蛋白排出量、腎重/體重、肌酐

3、清除率均有顯著性差異。3、不同時(shí)間點(diǎn)亞組間比較：正常對(duì)照組血糖、尿量無(wú)明顯差異,體重隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加；糖尿病組各時(shí)間點(diǎn)上大鼠體重隨時(shí)間延長(zhǎng)未見(jiàn)明顯增加,血糖及尿量組間有所差異,但并未體現(xiàn)出具有一定規(guī)律的變化趨勢(shì)。正常組大鼠24小時(shí)尿蛋白排出量、腎重/體重、肌酐清除率均無(wú)明顯差異,DM組24小時(shí)尿蛋白排出量呈現(xiàn)出隨病程延長(zhǎng)逐漸增加的趨勢(shì)；腎重/體重各時(shí)間點(diǎn)上有差異,但未見(jiàn)明顯的隨病程進(jìn)展的變化趨勢(shì)；肌酐清除率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。4、

4、光鏡下,NC組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常,DN可見(jiàn)腎小球基底膜增厚,而部分DM組大鼠僅見(jiàn)腎小球腫脹,而無(wú)明顯的基底膜增厚。隨病程進(jìn)展未見(jiàn)DM大鼠腎臟有時(shí)間特異特征性病理學(xué)改變,但隨病程進(jìn)展出現(xiàn)的腎臟病變程度不同,基底膜增厚的程度逐漸加重,并且出現(xiàn)明顯腎臟病理性變化的大鼠的數(shù)目漸增多。 結(jié)論：腹腔注射STZ可成功誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型,隨時(shí)間延長(zhǎng)24小時(shí)尿蛋白排出量及肌酐清除率呈現(xiàn)規(guī)律性變化,于24周時(shí)腎臟出現(xiàn)明顯的病理性改變。因此,STZ誘

5、導(dǎo)的糖尿病大鼠模型可以作為研究糖尿病早期腎臟病變的理想動(dòng)物模型。 第二部分 糖尿病大鼠腎臟早期病變的代謝組學(xué)研究 目的：通過(guò)對(duì)糖尿病大鼠早期腎臟病變模型血、尿標(biāo)本的代謝組學(xué)研究,尋找糖尿病及糖尿病早期腎臟病變的特征性代謝產(chǎn)物,探尋高血糖對(duì)腎臟病變的分子機(jī)制。 方法：1、LC/MS方法檢測(cè)動(dòng)物模型血、尿標(biāo)本的所有小分子代謝產(chǎn)物,描記代謝譜；確定糖尿病早期腎臟病變陽(yáng)性和陰性病例,采用PLS-DA和OPLS對(duì)代謝組數(shù)據(jù)

6、分析,根據(jù)所得小分子物質(zhì)的質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間,預(yù)測(cè)與糖尿病早期腎臟病變相關(guān)的特征性代謝產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu),并定量分析其在各組間水平。2根據(jù)獲得的特征性代謝產(chǎn)物的信息,依據(jù)支持向量機(jī)理論,以已確定診斷腎臟病變的大鼠代謝組數(shù)據(jù)為訓(xùn)練集,建立糖尿病大鼠早期腎臟病變的疾病診斷預(yù)測(cè)數(shù)學(xué)模型,對(duì)尿蛋白排出量、Kw/BW、Ccr不能明確診斷大鼠進(jìn)行疾病預(yù)測(cè),結(jié)果與病理診斷相比較,評(píng)價(jià)Maker及診斷預(yù)測(cè)模型的價(jià)值。 結(jié)果：1、DM與NC組大鼠血清的

7、代謝指紋圖譜有顯著不同,質(zhì)量數(shù)分別為588.323,566.339,540.321,568.353,303.229,554.341,564.321,339.228,327.229的小分子代謝產(chǎn)物在兩組的水平明顯差異。2、在糖尿病早期腎臟病變陽(yáng)性及陰性的病例中,血清代謝組學(xué)分析獲得特征性的小分子物質(zhì),質(zhì)核比分別為342.1831,314.2246,614.1820,399.3349,450.1936,130.0630,670.3843,3

8、42.1162,822.4051,432.3240,503.1791,898.5402,445.1710,489.1999。尿液標(biāo)本篩選出的小分子,質(zhì)核比為700.1428,131.0582,382.1310,552.4331。按荷載圖提示的對(duì)區(qū)分糖尿病早期腎臟病變的貢獻(xiàn)大小、與腎病的相關(guān)性及物質(zhì)源性,最終定量分析內(nèi)源性物質(zhì)亞鐵血紅素HEME和乙酰氨基丙酸。3、以上述2個(gè)marker的指紋圖譜信息作為參數(shù),建立疾病預(yù)測(cè)的數(shù)學(xué)模型,對(duì)28

9、只疑診腎臟病變的大鼠進(jìn)行診斷預(yù)測(cè),兩種預(yù)測(cè)方法結(jié)果與病理診斷的陽(yáng)性吻合率均為94.12％,陰性吻合率是87.50％和81.25％。 結(jié)論:LC/MS聯(lián)用的分析技術(shù)是研究糖尿病早期腎臟病變動(dòng)物模型的有效工具；亞鐵血紅素與5-氨基乙酰丙酸水平在糖尿病早期腎臟病變的病理狀態(tài)下有明顯改變,兩者在糖尿病早期腎臟病變的發(fā)病機(jī)制中可能起到重要作用。 第三部分 通絡(luò)方藥對(duì)糖尿病大鼠早期腎臟病變的保護(hù)作用 目的：比較通絡(luò)方藥不同給

10、藥時(shí)間即預(yù)防性干預(yù)和治療性干預(yù)對(duì)糖尿病大鼠早期腎臟病變的保護(hù)作用及其療效,并從代謝組學(xué)角度探討通絡(luò)方藥可能的作用機(jī)制。 方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物48只,隨機(jī)分為2組,每組包括NC組6只,DM組8只,TLR組10只,觀察時(shí)間分別為12W和24W。兩組TLR大鼠分別于DM造模成功后立即和模型成功后第12周后給予TLR干預(yù),分別定義為預(yù)防性給藥組和治療性給藥組。于即定時(shí)間處死兩組大鼠,并測(cè)定24小時(shí)尿蛋白排出量,血肌酐、尿肌酐及腎重計(jì)算KW/B

11、W、Ccr;取腎臟組織進(jìn)行光鏡HE染色病理學(xué)檢查。留大鼠血、尿標(biāo)本代謝組分析。 結(jié)果：1、預(yù)防性及治療性藥物干預(yù)抑制糖尿病大鼠早期腎臟病變所引起的尿蛋白排出和肌酐清除率升高。2、預(yù)防性給藥對(duì)糖尿病大鼠24小時(shí)尿量、尿蛋白排出量、肌酐清除率的改善率分別為59.45％、48.52％、51.40％;治療性給藥組相應(yīng)指標(biāo)改善率為21.59％、38.26％、44.29％。3、無(wú)論是預(yù)防性或是治療性藥物干預(yù),給藥組與糖尿病組代謝產(chǎn)物譜有明顯