玉米黑粉菌CYP51的克隆表達(dá)及同殺菌劑分子結(jié)合光譜分析.pdf

1、甾醇14α-去甲基化酶(也稱P45014-DM，CYP51)是唯一的廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物中的細(xì)胞色素P450家族成員。它被視為最古老的細(xì)胞色素P450家族成員。它催化甾醇的14α-去甲基化反應(yīng)。甾醇14α-去甲基化酶是真菌麥角甾醇合成過程的關(guān)鍵酶。抑制真菌甾醇14α-去甲基化酶將會(huì)阻礙真菌麥角甾醇的合成。麥角甾醇的缺失會(huì)損害細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致真菌死亡。目前農(nóng)業(yè)上14α-去甲基化酶抑制劑(14α-demethylati

2、oninhibitors，DMIs)類殺菌劑即是通過抑制真菌甾醇14α-去甲基化酶而發(fā)揮殺菌抑菌的作用。
　　 本研究首先從玉米黑粉菌中克隆CYP51基因，并構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-YH、pGEXKG-YH，采用不同的IPTG誘導(dǎo)濃度，不同的誘導(dǎo)溫度，不同的表達(dá)宿主菌表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析玉米黑粉菌CYP51基因均沒有得到有效的表達(dá)。通過對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)合SYBYL7.0同源模建分析結(jié)果，從而重新克隆了

3、2個(gè)玉米黑粉菌CYP51基因，即N端截短了的突變體（分別截短20和35個(gè)氨基酸），并構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒(pETYH-20,pETYH-35，pGEXKGYH-20,pGEXKGYH-35)，最終pETYH-35重組表達(dá)質(zhì)粒在E.coliBL21(DE3)中得到了大量表達(dá)，但是N端截短了20個(gè)氨基酸的突變體仍未能有效表達(dá)。
　　 將得到的重組玉米黑粉菌CYP51蛋白初步純化后測(cè)定蛋白質(zhì)含量，并根據(jù)P450-CO差光譜的方法測(cè)定其活

4、性及P450含量，得到其蛋白質(zhì)含量2.92mg/mL，P450含量為3.763pmol/mg。重組玉米黑粉菌CYP51蛋白同四種標(biāo)準(zhǔn)殺菌劑和十種人工合成的三唑類XF系列新型小分子殺菌劑進(jìn)行了結(jié)合光譜測(cè)定研究，根據(jù)重組CYP51和殺菌劑之間的結(jié)合光譜分型并采用米氏方程Hanes-Woolf作圖法計(jì)算結(jié)合常數(shù)，得到初步結(jié)論：標(biāo)準(zhǔn)殺菌劑和XF系列殺菌劑相比，結(jié)合常數(shù)均較小，標(biāo)準(zhǔn)殺菌劑中三唑醇的結(jié)合常數(shù)最小，結(jié)合常數(shù)為0.057；XF系列殺菌劑

5、中XF-113結(jié)合常數(shù)最小，結(jié)合常數(shù)為0.307。通過重組玉米黑粉菌CYP51蛋白和殺菌劑之間的結(jié)合常數(shù)，參考生物活性測(cè)定結(jié)果對(duì)殺菌劑殺菌效果進(jìn)行初步的評(píng)估，并由此推斷真菌CYP51同三唑類殺菌劑的分子構(gòu)型之間的聯(lián)系。通過生物信息學(xué)的手段對(duì)得到的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以便為設(shè)計(jì)開發(fā)新型的具有更強(qiáng)結(jié)合作用和更高選擇性DMIs類殺菌劑提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。本研究同時(shí)構(gòu)建了重組真核酵母表達(dá)質(zhì)粒pAUR123-YH，采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化后篩選陽性轉(zhuǎn)化子