蝎毒素選擇性誘導(dǎo)非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景和研究目的： 惡性淋巴瘤是淋巴結(jié)或淋巴結(jié)外部分淋巴組織的免疫細(xì)胞腫瘤，一般分為霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s Lymphoma）和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s Lymphoma，NHL）兩大類。我國(guó)霍奇金淋巴瘤的發(fā)病率總體較低，菲霍奇金淋巴瘤是最常見(jiàn)的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)近年來(lái)非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，在過(guò)去20年，它的發(fā)病率增加了75％，在發(fā)病率增長(zhǎng)最快的腫瘤中位居第3位

2、。因此NHL的防治工作一直是我國(guó)醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的重點(diǎn)，尋找安全有效的藥物是腫瘤治療中的重要課題。近年來(lái)動(dòng)物來(lái)源藥物越來(lái)越受重視，充分利用我國(guó)動(dòng)物資源開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤藥物，成為腫瘤研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容。 蝎毒作為中醫(yī)傳統(tǒng)藥材已經(jīng)應(yīng)用幾千年了。在中國(guó)第一部藥典《本草綱目》中，全蝎被用于治療多種疾病。蝎毒為傳統(tǒng)藥材全蝎的主要活性物質(zhì)，存在于蝎尾部毒囊內(nèi)，鰲刺時(shí)由鰲針排出?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蝎毒主要由蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩部分組成，蝎毒的主要活

3、性成分是蛋白質(zhì)。蝎毒具有廣泛的藥理學(xué)性質(zhì)，近年來(lái)國(guó)外對(duì)蝎毒的研究主要集中在膜通道阻滯的作用和抗毒素方面，罕見(jiàn)關(guān)于蝎毒抗腫瘤方面的研究報(bào)道，國(guó)內(nèi)的研究側(cè)重其抗腫瘤、抗風(fēng)濕、抗癲癇、抗炎、纖溶、鎮(zhèn)痛以及對(duì)心血管病的作用等方面；國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)蝎毒的抗腫瘤作用進(jìn)行了較多研究，從蝎及蝎毒的抗腫瘤作用、蝎毒的成分和主要成分的藥理作用、全蝎及蝎毒抗腫瘤的臨床應(yīng)用等方面分析，結(jié)果與結(jié)論顯示，蝎毒可抑制多種人類腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。但是，蝎毒素對(duì)腫

4、瘤細(xì)胞殺傷或生長(zhǎng)抑制具有一定的腫瘤差異性，有一定的腫瘤譜；而且有關(guān)蝎毒抗腫瘤作用與靶細(xì)胞基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)問(wèn)題目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制至今尚未完全闡明，這是一個(gè)值得探討的領(lǐng)域。 腫瘤的發(fā)生通常被認(rèn)為是由于細(xì)胞原癌基因的激活和抑癌基因的失活，擾亂了正常的增殖、分化和凋亡的調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞增殖過(guò)度而凋亡不足。PTEN（第10號(hào)染色體缺失性磷酸酶--張力蛋白同源性基因）基因是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因。它的蛋白產(chǎn)物具有脂

5、磷酸酶活性，其主要作用底物是磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3是PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵性組分，負(fù)責(zé)刺激正常細(xì)胞生長(zhǎng)以及抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。PTEN使PIP3形成PIP2，降低PIP3水平，抑制了Akt的活性，因此降低了Bad磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡；促進(jìn)了p27的表達(dá)，引起細(xì)胞周期停滯。已發(fā)現(xiàn)這種基因在淋巴瘤細(xì)胞中5％可發(fā)生突變，導(dǎo)致對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)失去抑制作用。 非霍奇金淋巴瘤（NHL）作為我國(guó)最常見(jiàn)淋

6、巴系統(tǒng)的惡性腫瘤，近年來(lái)雖然放療、化療及造血干細(xì)胞移植的有了極大發(fā)展，淋巴瘤的死亡率并沒(méi)有降低。人們致力于尋找新的、療效肯定、毒副作用小的化療藥物，尤其是作用于腫瘤發(fā)生環(huán)節(jié)的藥物。為了探討蝎毒在NHL，淋巴瘤治療中的應(yīng)用價(jià)值，我們研究了蝎毒對(duì)NHL，淋巴瘤細(xì)胞株Raji和Jurkat細(xì)胞及正常人外周血淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響。通過(guò)采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白PTEN、Akt、p-Akt、Bad、p-Bad、p27和PTE

7、N mRNA的改變，以進(jìn)一步闡明蝎毒的抗腫瘤作用的分子機(jī)制。 研究?jī)?nèi)容： 1、蝎毒素誘導(dǎo)NHL細(xì)胞株Raji和Jurkat細(xì)胞凋亡的作用； 2、蝎毒素對(duì)Raji和Jurkat細(xì)胞周期分布的影響； 3、蝎毒素誘導(dǎo)Raji和Jurkat細(xì)胞凋亡的重要分子及信號(hào)通路； 4、蝎毒素對(duì)Raji和Jurkat細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響。 研究方法： 1.甲基四唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)不同濃度、不同時(shí)間

8、點(diǎn)蝎毒素（BmK）對(duì)NHL細(xì)胞株及人正常外周血淋巴細(xì)胞的抑制作用 選用NHL細(xì)胞株Raji和Jurkat及人正常外周血淋巴細(xì)胞為研究對(duì)象，采用臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)， MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，由此確定各組的的IC50值。 2.細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法如下 2.1倒置相差顯微鏡觀察藥物作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化； 2.2 Hoechst3342熒光染色并利用熒光顯微鏡，觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化； 2.3 Anne

9、xin V-FITC和PI染色，流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率； 2.4 LY294002聯(lián)合蝎毒素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 在蝎毒素作用細(xì)胞前20分鐘加入終濃度對(duì)20μM的LY294002，然后蝎毒素處理細(xì)胞48 h，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 3.PI染色流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。 4.Western blot進(jìn)一步檢測(cè)蝎毒素處理前后細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相關(guān)蛋白

10、PTEN、Akt、p-Akt、Bad、p-Bad、p27蛋白水平變化。 5.半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（PT-PCR）檢測(cè)PTEN mRNA的表達(dá)。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較用t檢驗(yàn)，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。 研究結(jié)果： 1.臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)和MTT法均顯示：蝎毒素對(duì)NHL細(xì)胞株Raji和Jurkat細(xì)胞具有生長(zhǎng)的抑制作用，呈濃度、時(shí)間相關(guān)性。蝎

11、毒素對(duì)NHL細(xì)胞株和人外周血淋巴細(xì)胞（PBLs）作用48后，IC50分別為275.40μg/ml（Raji）、360.60μg/ml（Jurkat）和1110μg/mL（PBLs），各組間經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異（p<0.05）。以上結(jié)果提示：蝎毒素對(duì)NHL細(xì)胞株Raji和Jurkat細(xì)胞的增殖抑制作用強(qiáng)于人外周血淋巴細(xì)胞（PBLs），低濃度（≤500μg/ml）時(shí)對(duì)PBLs細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用不明顯。兩種NHL細(xì)胞株中，Raji細(xì)胞對(duì)蝎

12、毒素較敏感，強(qiáng)于Jurkat細(xì)胞。 2.蝎毒對(duì)淋巴瘤細(xì)胞凋亡的影響： 2.1倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：蝎毒處理Raji和Jurkat細(xì)胞48 h后，細(xì)胞大小不一，呈現(xiàn)細(xì)胞碎片及胞漿內(nèi)顆粒增多等特征，并最終死亡。 2.2 Hoechst3342染色熒光顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，蝎毒素處理組中Raji和Jurkat細(xì)胞核均呈現(xiàn)碎塊狀致密濃染，熒光染色增強(qiáng)；隨著濃度增高，凋亡小體產(chǎn)生，符合凋亡的形態(tài)學(xué)改變。

13、2.3 Annexin V-FITC/PI染色FCM檢測(cè)顯示：蝎毒素能夠誘導(dǎo)Raji和Jurkat細(xì)胞株凋亡，其凋亡率隨用藥劑量增加而增加，并且Raji細(xì)胞的早期凋亡率（43±7％）明顯高于Jurkat細(xì)胞（24±5％），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。蝎毒素作用PBLs細(xì)胞48小時(shí)后，各濃度組凋亡率較空白對(duì)照組的差異未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。以上結(jié)果提示：蝎毒素可選擇性作用于NHL細(xì)胞株誘導(dǎo)其凋亡，而對(duì)人正常外周血淋巴細(xì)胞影響較

14、小。 3.PI染色流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：蝎毒素引起NHL細(xì)胞株Raji和Jurkat細(xì)胞G0/G1期阻滯。 4.Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：蝎毒素促使Raji細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)增加，同時(shí)p-Akt、p-Bad蛋白表達(dá)減少；而對(duì)Jurkat細(xì)胞以上蛋白表達(dá)無(wú)影響。提示蝎毒素誘導(dǎo)PTEN蛋白表達(dá)上調(diào)，且該P(yáng)TEN蛋白為功能性蛋白，可以下調(diào)Akt、Bad磷酸化水平，從而影響PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這可能是

15、蝎毒素誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。 5.為了進(jìn)一步驗(yàn)證PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在蝎毒素誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡中的作用，LY294002（PI3K特異抑制劑）聯(lián)合蝎毒素對(duì)Raji細(xì)胞的影響。發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥呈現(xiàn)疊加效應(yīng)，不僅使Raji細(xì)胞凋亡率明顯增加，同時(shí)使Akt磷酸化水平進(jìn)一步降低。由此我們判斷，蝎毒素通過(guò)上調(diào)PTEN表達(dá)水平，激活PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是蝎毒素誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。 6.RT-P

16、CR法測(cè)PTEN mRNA的表達(dá)水平，Raji細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)PTEN mRNA表達(dá)呈蝎毒素濃度依賴性增加，說(shuō)明蝎毒素是在PTEN基因轉(zhuǎn)錄水平影響PTEN蛋白表達(dá)。 7.Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：蝎毒素作用Raji和Jurkat細(xì)胞48 h后，伴隨著G1期阻滯，p27蛋白表達(dá)呈蝎毒素濃度依賴性增加。提示蝎毒素促使Raji和Jurkat細(xì)胞凋亡的機(jī)制還與上調(diào)p27蛋白進(jìn)而導(dǎo)致G1期細(xì)胞阻滯有關(guān)。 結(jié)論： 蝎毒素能

17、夠抑制NHL細(xì)胞株Raji和Jurkat細(xì)胞的增殖，并且呈時(shí)間、濃度依賴性?？梢哉T導(dǎo)Raji和Jurkat細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期G1期阻滯的能力。可能是通過(guò)以下的機(jī)制發(fā)揮作用的：1、在PTEN基因轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)Raji細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)，抑制Akt、Bad的磷酸化，從而激活P13K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這可能是蝎毒素誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。2、還可以通過(guò)菲PTEN依賴途徑，上調(diào)p27蛋白的表達(dá)，引起G1期細(xì)胞周期停滯，這是蝎毒誘