吸入一氧化碳防治肢體嚴(yán)重缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肢體缺血再灌注(IR)損傷常發(fā)生于肢體擠壓傷、肢體高位離斷再植、腹主動脈瘤手術(shù)等患者的轉(zhuǎn)歸過程中。肢體缺血的時間越長,IR損傷表現(xiàn)越重,嚴(yán)重者可引起肢體壞死,不得已而行截肢手術(shù)。更嚴(yán)重的是,由缺血區(qū)組織細(xì)胞產(chǎn)生釋放的活性氧物質(zhì)及炎癥介質(zhì)可引發(fā)全身性IR損傷,進(jìn)而引起腎等多器官功能障礙。因此,及早采取有效措施防治肢體IR損傷是整體救治的重要環(huán)節(jié)。研究表明,信使分子一氧化碳(CO)具有抗炎、抗氧化損傷的重要功效,在機(jī)體遭遇器官IR損傷的病理

2、過程中,CO發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。本課題組先前的研究證實(shí),給予適量外源性CO可有效減輕大鼠肢體IR損傷。但前期研究所用動物模型的肢體缺血時間為4 h,缺血程度相對較輕。給予外源性CO對肢體嚴(yán)重IR損傷有何影響,尚需進(jìn)一步觀察研究。
　　 目的:本實(shí)驗(yàn)擬通過夾閉大鼠股動脈8h再開放的方法復(fù)制肢體嚴(yán)重IR損傷模型,使模型動物吸入含CO的醫(yī)用空氣后,觀測血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肢體濕干(W/D)重比值和病理學(xué)指標(biāo)的變化

3、,以探討吸入CO對肢體嚴(yán)重IR損傷的效應(yīng),為最終將吸入CO的辦法應(yīng)用于防治肢體嚴(yán)重IR損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:(1)動物分組:健康、清潔、雄性SD大鼠56只,隨機(jī)分為IR組(24只)、IR+CO(RC)組(24只)、假手術(shù)(S)組(8只)。在IR、RC組中,8只用于10 d存活率的觀測;8只于再灌注6 h時取材,另8只于再灌注12 h時取材,用于LDH、CK.、肢體W/D和病理學(xué)指標(biāo)的觀測。S組中,4只與再灌注6 h組對

4、比觀測,另4只與再灌注12 h組對比觀測。(2)模型復(fù)制:本實(shí)驗(yàn)采用無創(chuàng)血管夾在雙側(cè)后肢根部夾閉股動脈,并用橡皮筋綁扎后肢根部,以此造成雙側(cè)后肢缺血。根據(jù)文獻(xiàn)提示,并經(jīng)本實(shí)驗(yàn)證實(shí),缺血達(dá)8 h以上者再灌注后血壓下降,呈現(xiàn)休克表現(xiàn)。據(jù)此,本實(shí)驗(yàn)將缺血時間確定為8 h,以此建立肢體嚴(yán)重IR動物模型。S組動物模擬手術(shù)過程,但不造成肢體缺血。(3)吸入CO的方法:RC組動物吸入CO,把動物置于特制的器皿中,通入含有CO的醫(yī)用空氣,CO的體積分?jǐn)?shù)

5、為0.075％。于再灌注前2 h時開始持續(xù)吸入含有CO的醫(yī)用空氣,直至再灌注后4 h,共計吸入6 h。S、IR組暴露于空氣中,自由呼吸。(4)10 d存活率觀測:IR、RC組各取8只大鼠,于再灌注過程中,觀測尾動脈收縮壓的變化和10 d存活率。(5)血清LDH、CK活性測定:IR、RC組,分別于再灌注6 h、12 h時,S組于對應(yīng)的手術(shù)后時間點(diǎn),在深度麻醉下經(jīng)右心房采血各5mL,靜置,離心,取上清液送全自動生化分析儀檢測血清LDH、CK

6、活性。(6)肢體W/D重比值測定:上述動物經(jīng)心房采血后,把左側(cè)后肢從髖關(guān)節(jié)處截斷,用電子分析天平測量其濕重,在60℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中干燥7天,待水分完全析出后測其干重,算得W/D。(7)病理學(xué)觀察:從髖關(guān)節(jié)處截取上述動物右側(cè)后肢,對肢體腫脹程度、皮下滲出情況及壞死粘連程度、肌肉顏色、質(zhì)地等進(jìn)行大體觀察。其后,剝?nèi)テつw,將小腿部分進(jìn)行固定,把小腿三頭肌切成組織塊,石蠟包埋、切片,HE染色,光鏡觀察肌組織病理學(xué)變化。
　　 結(jié)果:(

7、1)大體觀察結(jié)果:S組,肢體形態(tài)大小正常,皮下無出血及滲出物,肌肉顏色暗紅、彈性好。IR組,肢體明顯腫脹,皮下組織內(nèi)、肌間隔內(nèi)有血色滲出液,并可見大量淺黃色、膠狀滲出物,肌肉色澤深暗,成褐色,彈性差。RC組,肢體的腫脹程度較IR組明顯減輕,皮下組織、肌間隔內(nèi)血色滲出液及膠狀滲出物明顯減少,肌肉顏色較IR組顯蒼白,彈性中等。(2)肢體W/D重比值:S組,W/D最低,IR組W/D最高,RC組W/D居中。IR組和RC組相比,RC組和S組相比,

8、均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。(3)HE染色觀察結(jié)果:S組,骨骼肌細(xì)胞形態(tài)正常,胞漿均勻、紅染,胞核無變形,核仁清晰;肌束明顯,胞間無炎性細(xì)胞浸潤。IR組,骨骼肌細(xì)胞胞體增大,部分肌細(xì)胞變性、壞死,肌漿溶解、破壞,胞核消失,呈空泡狀;肌束斷裂,胞間有大量的中性粒細(xì)胞浸潤,并廣泛出血。與再灌注6 h相比,再灌注12 h者病理表現(xiàn)更為嚴(yán)重。RC組,可見部分肌細(xì)胞變性,肌漿含有空泡,呈灶狀溶解,大部分肌細(xì)胞腫大程度減輕,肌漿染色接近正常,胞

9、核染色及位置趨近正常,未見核固縮;骨骼肌細(xì)胞間有少量單核細(xì)胞浸潤,出血減輕。(4)血清LDH和CK活性檢測結(jié)果:6 h取材者:IR組和RC組相比,有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);RC組和S組相比,無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);12 h取材者:IR組和RC組相比,RC組和S組相比,均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。(5)10 d存活率:IR組,再灌注后大鼠尾動脈收縮壓開始降低,其下降過程可區(qū)分為四個時相:第一時相,再灌注0-2 h,為血壓快速

10、下降期,至2 h前后,尾動脈平均收縮壓為8.6708±0.5992 kpa;第二時相,再灌注2-4 h,下降幅度較小,為血壓相對穩(wěn)定期;第三時相,再灌注4.8 h,為血壓緩慢下降期,至再灌注8 h時尾動脈平均收縮壓為5.3259±0.3832 kpa;第四時相,再灌注8h-死亡,為持續(xù)低血壓期,尾動脈收縮壓波動在5 kpa上下,動物處于持續(xù)休克狀態(tài),再灌注13-14 h間有6只大鼠死亡,另外2只再灌注至20 h前后死亡,10 d存活率為

11、0。RC組,尾動脈收縮壓的下降速率較慢、下降幅度較小,與IR組的四個時相比照:第一時相,血壓也快速下降,但下降幅度顯著變小,再灌注至2 h前后,尾動脈平均收縮壓為10.3843±1.3111 kpa;第三時相,血壓下降的速率和幅度均明顯降低,至再灌注8 h時尾動脈平均收縮壓為8.3300±0.4224 kpa;第四時相,血壓未出現(xiàn)下降,且穩(wěn)中有升,至再灌注13 h時尾動脈平均收縮壓為9.4157±0.3305 kpa,8只大鼠中1只在再

12、灌注至20 h前后死亡,其余7只再灌注10 d后仍存活,且狀態(tài)良好,10 d存活率為7/8。
　　 結(jié)論:(1)大鼠肢體缺血8 h者,再灌注過程中血壓明顯下降,出現(xiàn)休克表現(xiàn),10 d存活率為0。據(jù)此認(rèn)為,使大鼠兩側(cè)后肢持續(xù)缺血8 h行再灌注,以此可復(fù)制肢體嚴(yán)重IR模型。(2)及早給予外源性低濃度CO,可穩(wěn)定動物血壓,防止休克發(fā)生,顯著提高肢體嚴(yán)重IR損傷大鼠的生存率。(3)及早給予外源性低濃度CO,可顯著減輕肢體IR損傷,降低肢