應激性反應原作用于MicroRNA與CD44之間表達平衡進而影響胃癌干細胞的表型形成的初步研究.pdf

1、腫瘤干細胞假說認為腫瘤中存在一小部分亞群細胞，其生長特性類似與正常干細胞，具有自我更新，維持腫瘤生長和保持腫瘤異質性的能力。雖然該理論遠未成熟，而且還存有諸多科學問題亟待解決，但經(jīng)過學者們不懈努力，越來越多的證據(jù)和實驗結果均證實了腫瘤干細胞的存在。2009年，Takaishi等從胃癌細胞系中分離得到了CD44表達陽性的細胞亞群，這些CD44+細胞具有腫瘤干細胞自我更新和腫瘤異質性的能力，還能夠對化、放療誘導的細胞程序性凋亡產生抵抗作用。

2、
　　 目的：選擇CD44作為分離標記，研究其在胃癌原發(fā)灶及轉移灶組織內的表達，通過酶消化聯(lián)合化療藥物篩選法分離胃癌干細胞，并對原代分離培養(yǎng)的胃癌干細胞的表型進行檢測。以MicroRNA和CD44之間表達平衡為突破口，研究應激性反應原如何作用與這兩者之間平衡影響干細胞的表型形成，為進一步從新的角度揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的可能分子機制，并針對腫瘤干細胞為靶點，為開辟早期診斷、治療胃癌的新途徑奠定方法和理論基礎。
　　 方法：所有

3、細胞培養(yǎng)均使用10％胎牛血清，加入配好的抗生素液體中（青/鏈霉素100U/mL、100μg/mL）。細胞表型檢測使用流式細胞儀（BD FAcscalibur）分選，未加熒光標記一抗的腫瘤細胞作為空白對照。western blot檢測CD44、Lin28在胃癌原發(fā)灶和轉移灶的表達。半定量RT-PCR及實時定量PCR檢測miR-373的表達，雙螢光素酶檢測分析STAT3和AP-1表達水平，實時定量PCR檢測異丙腎上腺素處理后胃癌細胞系表面標

4、記Rex-1和Nanog表達，Western blot結果表明β-腎上腺素受體在胃癌原發(fā)灶及轉移灶表達。
　　 結果：雖然胃癌原發(fā)灶及轉移灶內均存在著CD44+亞群細胞，但是相比原發(fā)灶，轉移灶內CD44+亞群細胞的比例顯著上調（約30倍）。Western blot檢測從蛋白水平上證實了CD44、Lin28在胃癌原發(fā)灶和轉移灶組織內存在著表達差異。化療藥物篩選培養(yǎng)結果顯示，CD44+亞群細胞能夠對奧沙利鉑產生抵抗，并且能夠逃避奧沙

5、利鉑誘導產生的細胞程序性死亡。篩選培養(yǎng)后CD44+細胞不但具有強大的分離增殖能力，而且能夠在體外培養(yǎng)形成球體克隆。
　　 miR-373在胃癌原發(fā)灶及轉移灶組織存在表達差異。miR-373在原發(fā)灶內表達的量遠遠高于其在轉移灶內的表達量。miR-373可能通過正向調控E-cadherin影響EMT，從而影響腫瘤細胞的侵襲能力。miR-373能夠在體內和體外抑制CD44的表達，影響胃癌干細胞的表型轉化。miR-373的啟動子區(qū)域含有

6、STAT3和AP-1結合位點，其上游信號通路活化后，通過激活STAT3信號通路和JNK/SAPK信號通路，抑制miR-373的功能，間接地促進CD44的表達，使細胞表型向胃癌干細胞的方向發(fā)生偏移。應激性反應原與其受體結合后，激活β腎上腺素受體-cAMP-PKA信號通路，從而上調STAT3和c-Jun的表達水平，影響miR-373的剪切及成熟，間接地抑制CD44的表達及胃癌干細胞的表型形成。
　　 結論：轉移灶內CD44+亞群細胞