膽堿能系統(tǒng)功能障礙對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶和海馬自發(fā)放電活動的影響及其機制研究.pdf

1、隨著我國人口老齡化的發(fā)展，老年病的防治特別是阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)即老年性癡呆的研究已成為本世紀(jì)生命科學(xué)最具挑戰(zhàn)的課題之一。AD是老年人群中一類常見的中樞神經(jīng)退行性疾病，臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙，晚期出現(xiàn)嚴(yán)重癡呆。AD發(fā)病率高、危害大、造成的家庭和社會負(fù)擔(dān)日益嚴(yán)重，已經(jīng)被稱為是影響老年人健康和人類壽命的第四大殺手。
　　 腦內(nèi)的膽堿能系統(tǒng)對人與動物的認(rèn)知功能活動至關(guān)重要。在AD患者中

2、，其腦內(nèi)Meynert基底核(NBM)內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元幾乎完全被破壞。此外，AD患者的腦組織病理檢查還發(fā)現(xiàn)，基底前腦與大腦皮層等與認(rèn)知功能活動密切相關(guān)的腦區(qū)存在有高密度的老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)等特征性的AD病理改變。這些研究提示，腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)功能障礙可能與AD患者認(rèn)知功能下降密切相關(guān)，對基底前腦膽堿能神經(jīng)元的進(jìn)一步研究或許是解開AD之謎的最佳途徑。
　　 海馬神經(jīng)元表達(dá)煙堿型膽堿能受體(nicotinic acetylchol

3、ine receptors，nAChRs)和毒蕈堿型膽堿能受體(mAChRs)，這兩種受體在維持海馬正常的生理活動中起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，nAChRs廣泛參與各種生理過程，特別是學(xué)習(xí)和記憶。一個重要的發(fā)現(xiàn)是，除了NBM中膽堿能神經(jīng)元數(shù)量減少外，AD病人大腦皮層和海馬等腦區(qū)中的乙酰膽堿以及nAChRs數(shù)量也明顯減少，并且隨著疾病的進(jìn)展，nAChRs的缺陷日漸加重。因而，治療AD的藥物膽堿酯酶抑制劑正是基于對AD患者腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)功

4、能顯著低下這一特征試圖通過增加突觸間隙中的乙酰膽堿水平而設(shè)計的。然而，目前多數(shù)藥物包括膽堿酯酶抑制劑并不能改變、更不能逆轉(zhuǎn)AD的病程進(jìn)展。這可能與膽堿能系統(tǒng)損傷所致認(rèn)知功能障礙的發(fā)生機制還不明確有關(guān)。例如，NBM的損傷到底在多大程度上影響認(rèn)知功能活動，其影響行為學(xué)活動的受體機制以及對腦內(nèi)神經(jīng)環(huán)路的電信號是否和如何影響還不清楚。因此，本研究采用在體電生理技術(shù)和學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)測試手段分別研究了Meynert基底核損傷和nAChRs激動劑的應(yīng)

5、用對大鼠海馬神經(jīng)元放電類型和放電頻率、以及對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)改變的影響。通過破壞腦內(nèi)基底核以模擬AD時腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)的功能障礙，在此基礎(chǔ)上給予N型膽堿能受體激動劑可進(jìn)一步分析N型膽堿能受體在大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶活動中的可能作用，由此準(zhǔn)確反映腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)的實際作用。通過應(yīng)用多通道神經(jīng)信號采集系統(tǒng)觀察腦內(nèi)基底核神經(jīng)元損傷、N亞型膽堿能受體激動劑對大鼠海馬神經(jīng)元自發(fā)放電類型及頻率的影響，有助于了解膽堿能系統(tǒng)在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動中的作用，進(jìn)一步

6、探討AD發(fā)病的膽堿能機制，為預(yù)防和治療AD提供新的思路和理論依據(jù)。實驗具體分以下兩部分進(jìn)行：
　　 第一部分：基底核毀損對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶行為的影響
　　 目的：基底前腦Meynert基底核(NBM)對學(xué)習(xí)和記憶功能活動具有重要作用，其神經(jīng)元退行性變的程度也是決定AD進(jìn)展過程的關(guān)鍵。為探討膽堿能系統(tǒng)功能障礙與AD認(rèn)知功能下降的關(guān)系及其發(fā)生機制，本實驗應(yīng)用Morris水迷宮測試手段觀察了大鼠NBM毀損對大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能

7、力的影響，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢查了側(cè)腦室補充膽堿后大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能力的改變。
　　 方法：實驗選用反應(yīng)靈活、無視覺和運動障礙的SD雄性大鼠，在水合氯醛麻醉和腦立體定位儀引導(dǎo)下，應(yīng)用微量注射器將海人藻酸(KA)或生理鹽水緩慢注射到雙側(cè)NBM內(nèi)，同時用另一微量注射器將膽堿或生理鹽水等藥物緩慢注入右側(cè)側(cè)腦室，待動物清醒并恢復(fù)一周后，進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)測試。Morris水迷宮是用來衡量動物學(xué)習(xí)和記憶能力的經(jīng)典的實驗手段，主

8、要包括三部分測試內(nèi)容：定位航行試驗，空間探索試驗和可視平臺試驗，分別檢查大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶功能和除外視力及運動功能障礙。主要觀察指標(biāo)有：大鼠逃避潛伏期、到達(dá)平臺游過距離、目標(biāo)象限(即平臺所在象限)內(nèi)游泳所占的時間和距離百分比等。
　　 結(jié)果：(1)使用KA(0.5％，2μl)損毀NBM后，大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶功能明顯受損。(2)單獨給予大鼠側(cè)腦室高濃度的膽堿可以改善其空間學(xué)習(xí)和記憶能力。注射500μM(2μl)膽堿后，在測試的第

9、1，2，3，4，5天，大鼠逃避潛伏期及找到平臺所游過的距離分別為57.8±3.8s38.3±4.2s，25.9士3.6s，9.8±2.1s，8.8士2.3s和1271.0±90.6cm,827.5士83.5cm，576.4±80.4cm，228.3±54.8cm和194.4±50.9cm,與對照組相比，明顯縮短(p＜0.01)。在第6天的空間探索實驗中，注射了膽堿的大鼠處于正確象限的時間和游泳距離占游泳總時間和總距離的百分比為58％±1

10、.0和54％1.5，明顯高于對照組(p＜0.01)。(3)在NBM損傷合并膽堿補充組，低濃度(5μM,2μl)膽堿補充對NBM損毀誘發(fā)的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷有輕微的改善作用。測試前5天大鼠逃避潛伏期為93.0±8.2s，74.9±7.0s，52.6±6.0s，39.6±3.6s和33.8±4.0s，游泳距離為2026.3士158.9cm，1503.6士102.7cm,1019.3士67.8cm，783.6±81.0cm和606.6士14

11、0.7cm，第6天處于正確象限的時間和游過距離占游泳總時間和總距離的百分比為37.25％±0.9和37.25％±0.75，與NBM損毀組相比，均無顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)。給予高濃度膽堿(500μM，2μl)則可逆轉(zhuǎn)NBM損傷所致的學(xué)習(xí)、記憶功能障礙。與單純NBM損毀組相比，高濃度膽堿處理后，定位巡航實驗中逃避潛伏期分別為79.9±3.6s，55.0±3.3s，33.2±4.0s，19.4士3.5s和15.4±1.4s；游過距離

12、為1742.8±115.6cm，1200.9士76.0cm,703.6±58.5cm,402.1士65.3cm和345.6±34.0cm(各訓(xùn)練日p＜0.01)；空間探索實驗大鼠處于正確象限的游泳時間和距離占總時間和總距離的百分比增加到49.6％±0.7和46.0％±1.1(p＜0.01)。(4)在可視平臺條件下，以上各組動物平均逃避潛伏期分別為10.1±1.2s，11.1士0.9s，10.4±1.2s，10.4士1.3s和10.8±1

13、0.s，游泳速度分別為23.1士2.3cm/s，22.8士1.4 cm/s，23.6±3.1 cm/s，23.5士1.8 cm/s，23.4士2.6 cm/s(p＞0.05)，表明NBM損毀和膽堿處理并未影響大鼠的視力和運動功能。
　　 結(jié)論：使用KA將NBM毀損后，可以造成大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶功能顯著下降，而較大劑量的膽堿補充可逆轉(zhuǎn)KA誘導(dǎo)的空間學(xué)習(xí)和記憶傷害。這提示，NBM膽堿能系統(tǒng)特別是nAChRs可能在維持大鼠認(rèn)知功能活動

14、中具有重要意義，其功能活動的上調(diào)可能有助于AD的預(yù)防和治療。
　　 第二部分：基底核毀損對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自發(fā)放電活動的影響
　　 目的：為了探討以上實驗中NBM毀損影響大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的電生理機制，本實驗應(yīng)用多電極細(xì)胞外記錄技術(shù)觀察了NBM毀損和nAChR激動劑膽堿對海馬神經(jīng)元自發(fā)放電活動的影響，以期探索阿爾茨海默病膽堿能系統(tǒng)功能障礙影響認(rèn)知活動的神經(jīng)環(huán)路機制。
　　 方法：實驗采用成年雄性SD大鼠。

15、在水合氯醛麻醉和腦立體定位儀引導(dǎo)下，應(yīng)用微量注射器將海人藻酸(KA)或生理鹽水緩慢注射到雙側(cè)NBM，一周后記錄大鼠海馬CA1區(qū)自發(fā)放電活動。電生理實驗記錄之前，用烏拉坦將大鼠麻醉后固定在腦立體定位儀上，將腦室套管和改裝的平行綁定多電極分別精確定位到側(cè)腦室和海馬CA1區(qū)記錄部位。在電極推進(jìn)之前，急性側(cè)腦室給予膽堿或生理鹽水。當(dāng)電極接近預(yù)定部位時，緩慢、精細(xì)調(diào)節(jié)下插深度，每次推進(jìn)30μm，直至出現(xiàn)自發(fā)放電。放電信號幅度與噪音的比值要求達(dá)到4

16、∶1以上。待觀察到穩(wěn)定、滿意的放電活動后，確定檢測動作電位的閾水平，保證用于鋒電位分類的信號無噪音混入，然后開始記錄。自發(fā)放電信號由微電極放大器放大、濾波后，實時在線進(jìn)行鋒電位分類和離線分析。主要觀察指標(biāo)為海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自發(fā)放電類型及放電頻率。
　　 結(jié)果：(1)對照組大鼠在海馬CA1區(qū)共記錄到自發(fā)性單單位放電神經(jīng)元49個，平均放電頻率5.55士0.64 Hz；放電類型包括規(guī)則型放電、爆發(fā)式放電和不規(guī)則型放電三種類型。(2)

17、NBM毀損組大鼠CA1區(qū)神經(jīng)元平均自發(fā)放電頻率明顯減少，與對照組相比有顯著性差異；其中，單個放電與爆發(fā)式放電類型的平均放電頻率均降低。(3)在NBM毀損基礎(chǔ)上，側(cè)腦室給予500μM膽堿后，大鼠海馬CA1區(qū)的平均放電頻率雖然仍低于空白對照組，但較單純NBM損毀大鼠明顯增加，平均放電頻率為4.34士0.87 Hz。(4)NBM毀損組的神經(jīng)元自發(fā)放電類型較對照組明顯不同，規(guī)則型由67％明顯減少至46％；爆發(fā)式放電神經(jīng)元數(shù)量由21％增加至46％