自噬在維持急性冷暴露大鼠肝臟能量代謝中的作用.pdf

1、背景：
　　冷暴露是常見的特殊環(huán)境暴露因素。以往的研究發(fā)現(xiàn)，-15℃急性冷暴露0.5h可以引起大鼠肝臟能量水平的改變及相關(guān)細(xì)胞通路活性的變化，復(fù)方制劑可以顯著緩解急性冷暴露大鼠體溫下降，但其機(jī)制仍不清楚。自噬是細(xì)胞正常生理過程，可以清除損傷細(xì)胞器，提供能量代謝底物并抑制凋亡發(fā)生；能量應(yīng)激情況下，自噬可以維持細(xì)胞ATP水平。設(shè)想急性冷暴露能否引起肝臟細(xì)胞自噬水平改變及其產(chǎn)生的影響，復(fù)方制劑能否影響急性冷暴露大鼠肝臟能量水平及自噬是否

2、參與復(fù)方制劑提高大鼠耐寒能力的過程值得探討。
　　目的：
　　通過建立大鼠急性冷暴露模型，觀察急性冷暴露對(duì)大鼠肝細(xì)胞能量水平及細(xì)胞凋亡的影響，探討自噬水平變化產(chǎn)生的影響及調(diào)控機(jī)制，并進(jìn)一步探討自噬在復(fù)方制劑調(diào)控急性冷暴露條件下大鼠肝細(xì)胞能量水平及細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制。為闡明急性冷暴露對(duì)機(jī)體造成的損傷、急性冷暴露過程中機(jī)體能量的調(diào)控及復(fù)方制劑提高耐寒能力的作用機(jī)制提供理論依據(jù)，為冷暴露條件下的機(jī)體防護(hù)措施提供理論基礎(chǔ)。

3、>　　方法：
　　1.急性冷暴露模型的建立：雄性SD大鼠230g±10 g體重，獨(dú)立暴露于-15℃低溫試驗(yàn)艙，暴露時(shí)間為4 h。
　　2.肝臟糖原含量測(cè)定：用肝糖原檢測(cè)試劑盒測(cè)定大鼠肝組織肝糖原水平。
　　3.肝臟細(xì)胞能量水平測(cè)定：用ATP檢測(cè)試劑盒，通過多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行發(fā)光度測(cè)定并得到大鼠肝細(xì)胞ATP含量值。
　　4.凋亡水平檢測(cè)：用western blot方法測(cè)定肝細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3活化水平及

4、TUNEL染色法觀察TUNEL陽性細(xì)胞。
　　5.自噬水平檢測(cè)：用western blot方法測(cè)定肝細(xì)胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達(dá)變化；用免疫組化方法，通過MDC染色方法進(jìn)行肝細(xì)胞自噬水平的檢測(cè)。
　　6.自噬抑制劑對(duì)機(jī)體的影響：采用腹腔注射的方法，降低自噬水平，同時(shí)觀察其對(duì)肝組織冷暴露應(yīng)激狀態(tài)下能量代謝可能產(chǎn)生的影響。
　　7.復(fù)方制劑對(duì)機(jī)體的影響：采用連續(xù)灌胃方法，持續(xù)灌胃3天。觀察能量及自噬水平的變化

5、。
　　結(jié)果：
　　1.急性冷暴露對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡水平的影響
　　-15℃急性冷暴露4 h引起大鼠肝細(xì)胞凋亡增加。急性冷暴露組大鼠肝細(xì)胞 caspase-3剪切水平顯著增加，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加（p＜0.05）。
　　2.急性冷暴露對(duì)大鼠肝臟ATP及肝糖原水平的影響
　　-15℃急性冷暴露4 h引起大鼠肝臟細(xì)胞ATP、肝糖原水平顯著下降。室溫對(duì)照組大鼠肝糖原5.03±0.86 mg/g，而冷暴露對(duì)照

6、組大鼠肝糖原降至2.24±1.03 mg/g；對(duì)照組大鼠ATP水平為0.293±0.018μmol/mg，冷暴露4 h組大鼠ATP水平降低至0.195±0.044μmol/mg。兩者均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。
　　3.急性冷暴露對(duì)肝臟自噬水平的影響
　　MDC染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，-15℃急性冷暴露4小時(shí)引起肝細(xì)胞自噬泡數(shù)量增加，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LC3-II灰度水平在急性冷暴露后顯著升

7、高（p＜0.05）。提示急性冷暴露引起大鼠肝臟自噬水平顯著增加。
　　4.自噬抑制劑對(duì)急性冷暴露大鼠肝臟細(xì)胞凋亡水平、能量水平及自噬水平的影響
　　腹腔注射自噬抑制劑渥曼霉素可以顯著降低肝細(xì)胞自噬水平（p＜0.05），渥曼霉素引起急性冷暴露大鼠肝細(xì)胞凋亡水平顯著升高，進(jìn)一步增加caspase-3蛋白的剪切及TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)量（p＜0.05），并引起肝細(xì)胞 ATP含量顯著降低，冷暴露抑制劑組大鼠ATP水平為0.146±

8、0.018μmol/mg與冷暴露對(duì)照組大鼠ATP水平0.193±0.047μmol/mg相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。而冷暴露抑制劑組大鼠肝糖原水平與冷暴露對(duì)照組大鼠相比無明顯差異。
　　5.復(fù)方制劑對(duì)急性冷暴露大鼠肝細(xì)胞凋亡水平、肝臟能量水平及肝細(xì)胞自噬水平的影響
　　復(fù)方制劑灌胃3天可以顯著降低急性冷暴露大鼠肝細(xì)胞凋亡水平（p＜0.05），并提高急性冷暴露大鼠的肝臟細(xì)胞 ATP及肝糖原水平，并同時(shí)降低肝組織的自噬水

9、平。冷暴露復(fù)方制劑組的大鼠ATP水平為0.236±0.018μmol/mg，與冷暴露對(duì)照組大鼠ATP水平0.187±0.030μmol/mg相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），冷暴露復(fù)方制劑組大鼠肝糖原2.20±1.24 mg/g，而冷暴露對(duì)照組大鼠肝糖原降至1.38±0.97 mg/g，相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.急性冷暴露可以引起大鼠肝細(xì)胞凋亡，肝細(xì)胞能量水平降低，并引起細(xì)胞自噬水平增加。<