七氟醚和氫氣的神經(jīng)保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、由于患者自身患有心腦血管疾病、手術(shù)因素和麻醉因素，造成圍手術(shù)期腦、脊髓缺血再灌注損傷的病例并不少見，而且一旦發(fā)生，后果極為嚴(yán)重。比如腦血管畸形手術(shù)腦缺血再灌注損傷的發(fā)生率高達(dá)42.9％，圍手術(shù)期腦中風(fēng)一旦發(fā)生，死亡率高達(dá)33-60％。胸腹主動(dòng)脈瘤手術(shù)因阻閉主動(dòng)脈造成脊髓缺血再灌注損傷，術(shù)后截癱的發(fā)生率高達(dá)10％以上。因此如何有效的預(yù)防和治療圍手術(shù)期腦、脊髓缺血再灌注損傷是臨床亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵問題。不同于普通的“腦中風(fēng)”或因意外造成的脊

2、髓損傷，圍手術(shù)期的腦、脊髓缺血再灌注損傷具有一定的可預(yù)見性。因此，采取早期干預(yù)措施預(yù)防和治療圍術(shù)期腦、脊髓損傷，不僅可行而且意義重大。
　　吸入麻醉劑作為臨床應(yīng)用最為廣泛的麻醉劑其神經(jīng)保護(hù)作用已越來越受到研究者的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證明缺血前給予吸入麻醉劑七氟醚預(yù)處理可以明顯減輕缺血-再灌注后脊髓神經(jīng)元損傷，改善動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)，但是其神經(jīng)保護(hù)作用的具體機(jī)制并不清楚。雙孔鉀通道是近年發(fā)現(xiàn)的一類新的鉀通道亞型，其中TREK-1高表達(dá)

3、于哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。新近的研究發(fā)現(xiàn)TREK-1通道的開放與神經(jīng)保護(hù)之間存在密切聯(lián)系。然而TERK-1分子是否參與吸入性麻醉劑預(yù)處理誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用有待明確。本研究第一部分旨在探討TREK-1在七氟醚預(yù)處理誘導(dǎo)的腦保護(hù)中扮演了什么角色，以其闡明七氟醚預(yù)處理的關(guān)鍵機(jī)制，為其臨床運(yùn)用提供新的科學(xué)依據(jù)。
　　在致力于尋找合適的預(yù)處理藥物和方案進(jìn)行預(yù)防的同時(shí)，我們同樣關(guān)注腦、脊髓損傷后的早期治療，因?yàn)樵缙谥委熭^之康復(fù)治療對于改善患者

4、預(yù)后具有更重要的意義。早期氫氣治療近年來在多類器官損傷中表現(xiàn)出一定療效，包括急性的腎臟、心臟、肝臟的缺血再灌注損傷，肺臟的炎癥損傷，以及膿毒血癥的治療等方面。一些研究證實(shí)，富含氫的鹽水或水可減輕創(chuàng)傷性脊髓損傷。此外，我們先期的研究結(jié)果顯示，吸入氫氣可明顯提高膿毒癥小鼠的生存率，減少多器官損傷。這些結(jié)果都提示我們，早期氫氣治療很可能對于脊髓缺血再灌注損傷有效。本研究第二部分主要探討氫氣在缺血性脊髓損傷早期治療中的作用及其相關(guān)機(jī)制。

5、　　第一部分TREK-1在七氟醚預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受中的作用機(jī)制研究
　　實(shí)驗(yàn)一七氟醚預(yù)處理對局灶性腦缺血-再灌注后TREK-1表達(dá)的影響
　　目的：探討七氟醚預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受時(shí)TREK-1表達(dá)的改變。方法：采用大腦中動(dòng)脈阻閉（MCAO）的方法，制作大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型。雄性Sprague-Dawley大鼠24只，隨機(jī)分為3組（n=8）：①預(yù)處理缺血組，大鼠接受2.7％七氟醚與97％氧氣混合吸入預(yù)處理45min

6、，60min后行MCAO90min；②單純?nèi)毖獙φ战M，大鼠接受97％氧氣吸入45min，60min后行MCAO90min；③假手術(shù)組，大鼠接受2.7％七氟醚與97％氧氣混合吸入預(yù)處理45min，但不行MCAO模型。分別于再灌注24、48、72h行神經(jīng)功能評分（NBS），末次評分后取腦行TTC染色并分析腦梗死容積結(jié)果。同時(shí)，另一部分動(dòng)物分為相同三組（n=12），分別于再灌注4、24、72h取材進(jìn)行Western-blot及Real-tim

7、ePCR實(shí)驗(yàn)，觀察腦部TREK-1在不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)變化情況。結(jié)果：（1）TTC結(jié)果分析：七氟醚預(yù)處理組再灌注72h后梗死容積小于單純?nèi)毖獙φ战M（P<0.05）。（2）神經(jīng)功能評分：假手術(shù)組動(dòng)物無運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能改變，預(yù)處理缺血組動(dòng)物評分均高于同一時(shí)間點(diǎn)單純?nèi)毖獙φ战M（P<0.05）。（3）蛋白含量：預(yù)處理缺血組動(dòng)物TREK-1蛋白表達(dá)量高于同一時(shí)間點(diǎn)單純?nèi)毖獙φ战M（P<0.05）。（4）mRNA：預(yù)處理缺血組動(dòng)物TREK-1mRNA轉(zhuǎn)錄水平

8、高于同一時(shí)間點(diǎn)單純?nèi)毖獙φ战M（P<0.05）。結(jié)論：七氟醚預(yù)處理后行局灶性腦缺血再灌損傷，腦組織中TREK-1較單純?nèi)毖M在轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均明顯增高。
　　實(shí)驗(yàn)二下調(diào)細(xì)胞TREK-1表達(dá)對七氟醚預(yù)處理誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用的影響
　　目的：在七氟醚預(yù)處理的體外培養(yǎng)細(xì)胞氧糖剝奪模型抑制TREK-1蛋白表達(dá)，明確TREK-1蛋白表達(dá)在七氟醚預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)中的作用。方法：（1）人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株（SH-SY5Y）誘導(dǎo)分化鑒定：根

9、據(jù)不同時(shí)間誘導(dǎo)分化后細(xì)胞的神經(jīng)元特異性核蛋白NeuN和神經(jīng)元骨架蛋白βⅢ-Tublin表達(dá)結(jié)果，確定細(xì)胞誘導(dǎo)分化為類神經(jīng)元的最佳時(shí)間。（2）細(xì)胞siRNA干擾與鑒定：向類神經(jīng)元細(xì)胞加入TREK-1小RNA干擾成品后測定TREK-1表達(dá)。（3）siRNA干擾對預(yù)處理效應(yīng)的影響：①對照組：細(xì)胞未經(jīng)siRNA干擾、七氟醚預(yù)處理和氧糖剝奪；②預(yù)處理+小RNA干擾+氧糖剝奪組：細(xì)胞經(jīng)siRNA干擾，24h后2.4％七氟醚預(yù)處理2h，24h后進(jìn)行氧

10、糖剝奪2h；③預(yù)處理+氧糖剝奪組：細(xì)胞未經(jīng)siRNA干擾，2.4％七氟醚預(yù)處理2h；④對照組+小RNA干擾+氧糖剝奪組：細(xì)胞經(jīng)siRNA干擾，24h后對照空氣處理2h，24h后進(jìn)行氧糖剝奪2h；⑤對照組+氧糖剝奪組：細(xì)胞未經(jīng)siRNA干擾，對照空氣處理2h，24h后進(jìn)行氧糖剝奪2h。所有細(xì)胞均于末次處理后24h行細(xì)胞爬片和蛋白提取。結(jié)果：（1）誘導(dǎo)分化鑒定：Western-blot和免疫熒光結(jié)果均顯示神經(jīng)元特異性核蛋白NeuN以及神經(jīng)元

11、骨架蛋白βⅢ-Tublin誘導(dǎo)分化7天組表達(dá)最強(qiáng)（P<0.05），因此確定誘導(dǎo)分化的時(shí)間為7天。（2）siRNA干擾與鑒定：Western-blot結(jié)果顯示小RNA抑制組TREK-1表達(dá)明顯減低，與溶劑對照組和亂序?qū)φ战M相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。(3)siRNA干擾對預(yù)處理效應(yīng)的影響：Western-Blot和免疫熒光結(jié)果均顯示：預(yù)處理+小RNA干擾+氧糖剝奪組凋亡蛋白Capase-3的表達(dá)量明顯升高，與對照組+氧糖剝奪組相比無

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與預(yù)處理+氧糖剝奪組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；MTT結(jié)果顯示預(yù)處理+小RNA干擾+氧糖剝奪組細(xì)胞OD值較預(yù)處理+氧糖剝奪組明顯降低，細(xì)胞死亡增加，與對照組+氧糖剝奪組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：細(xì)胞水平證實(shí)抑制TREK-1蛋白表達(dá)逆轉(zhuǎn)了七氟醚預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用，說明TREK-1介導(dǎo)了七氟醚預(yù)處理誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)三下調(diào)大鼠腦TREK-1表達(dá)對七氟醚預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受的影響
　　目的：研究在體抑制T

13、REK-1蛋白表達(dá)后，七氟醚預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受有無改變。方法：（1）活體siRNA干擾與鑒定：大鼠進(jìn)行單次siRNA側(cè)腦室注射，24h后取材，與對照組比較TREK-1表達(dá)情況；（2）siRNA干擾對缺血耐受性的影響：雄性SD大鼠90只，隨機(jī)分為5組（n=18）：①假手術(shù)組，大鼠僅行分離而不阻閉血管；②對照組，大鼠接受97％氧氣吸入45min；③預(yù)處理+MCAO組，大鼠接受2.7％七氟醚與97％氧氣混合吸入預(yù)處理45min；④小RNA

14、干擾+預(yù)處理+MCAO組，大鼠進(jìn)行單次siRNA側(cè)腦室注射，24h后大鼠接受2.7％七氟醚與97％氧氣混合吸入預(yù)處理45min；⑤小RNA干擾亂序?qū)φ?預(yù)處理+MCAO組，大鼠進(jìn)行單次siRNA亂序?qū)φ諅?cè)腦室注射，24h后大鼠接受2.7％七氟醚與97％氧氣混合吸入預(yù)處理45min。后四組均于處理后60min行MCAO90min。每組動(dòng)物分別于缺血-再灌注24、48、72h進(jìn)行雙盲神經(jīng)行為學(xué)評分，并在72h評分結(jié)束后取腦進(jìn)行TTC染色，觀

15、察腦梗死容積情況。結(jié)果：（1）神經(jīng)功能評分（NBS）：再灌注24、48、72h小RNA干擾預(yù)處理+MCAO組動(dòng)物NBS低于預(yù)處理+MCAO組（P<0.05），與對照組相同時(shí)間點(diǎn)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（2）TTC結(jié)果分析：再灌注72h小RNA干擾+預(yù)處理+MCAO組動(dòng)物腦梗死容積大于預(yù)處理+MCAO組（P<0.05）。結(jié)論：下調(diào)大鼠腦組織TREK-1表達(dá)后，七氟醚預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受作用消失，表明TERK-1蛋白表達(dá)上調(diào)是七氟醚預(yù)處理誘導(dǎo)腦

16、缺血耐受的重要機(jī)制。
　　第二部分氫氣治療脊髓缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制研究
　　實(shí)驗(yàn)一圍術(shù)期早期氫氣治療在兔脊髓缺血再灌注損傷中的作用
　　目的：探討早期氫氣治療在脊髓缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用。方法：濃度為1％，2％，4％的氫氣與麻醉氣體混合吸入，共同給予麻醉動(dòng)物，治療時(shí)間為脊髓缺血再灌注前10min及再灌注60min，總計(jì)70min。用儀器實(shí)時(shí)監(jiān)控H2濃度，使其達(dá)到預(yù)期濃度。圍術(shù)期（包括缺血前10min到再灌注6

17、0min）監(jiān)測動(dòng)脈血?dú)?、血糖。再灌?4、48及72h對動(dòng)物進(jìn)行后肢運(yùn)動(dòng)功能評估。在最后一次運(yùn)動(dòng)功能評估后，取L3-4節(jié)段，進(jìn)行組織HE染色，并進(jìn)行病理學(xué)檢查，計(jì)數(shù)前角剩余正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：各組間生理學(xué)參數(shù)，包括動(dòng)脈血壓、血?dú)夂脱菬o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對照組完全癱瘓，2％和4％氫氣吸入組，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)評分明顯高于對照組(P<0.05)，1％氫氣治療組與對照組相比較，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，4％組與2％組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在2％和4％

18、H2組，前角正常神經(jīng)元數(shù)目明顯多于對照組(P<0.05)，兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而1％H2組，前角剩余正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目與對照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：2％和4％氫氣吸入能明顯改善脊髓缺血再灌注損傷后動(dòng)物運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能，過低濃度（1％）氫氣吸入則無改善，4％與2％濃度組相比，并沒有使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能得到進(jìn)一步改善。
　　實(shí)驗(yàn)二氫氣吸入治療對兔脊髓缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響
　　目的：炎癥和氧化應(yīng)激是脊髓缺血再灌注損傷

19、的關(guān)鍵機(jī)制，本部分實(shí)驗(yàn)主要研究氫氣吸入能否調(diào)節(jié)脊髓缺血后的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)。方法：根據(jù)實(shí)驗(yàn)一結(jié)果，本部分采用2％氫氣吸入作為治療方案，進(jìn)一步進(jìn)行機(jī)制研究。18只動(dòng)物隨機(jī)分為3組（n=6）：假手術(shù)組（sham）、對照組、2％氫氣治療組。sham組不接受缺血，對照組和治療組接受缺血，方案同實(shí)驗(yàn)一。再灌注6、8、12、24、48及72h，檢測血清及缺血脊髓節(jié)段8-iso-PGF2α、MDA、SOD、CAT、TNF-α及HMGB1水平，結(jié)果進(jìn)

20、行統(tǒng)計(jì)分析，并在再灌注72h后，進(jìn)行TUNEL染色及caspase-3激酶活性檢測。結(jié)果：（1）在各時(shí)間點(diǎn)，H2治療組血清及缺血脊髓節(jié)段MDA和8-iso-PGF2α含量均低于缺血對照組(P<0.05)；（2）對照組血清和脊髓內(nèi)SOD和CAT的活性低于Sham組(P<0.05)，H2治療組SOD和CAT活性明顯高于缺血對照組(P<0.05)；（3）對照組血清和脊髓內(nèi)TNF-α和HMGB1明顯高于假手術(shù)組（P<0.05），而H2治療組在各