納米纖維支架在細(xì)胞外微環(huán)境仿生構(gòu)建中的應(yīng)用研究.pdf

1、細(xì)胞外微環(huán)境在細(xì)胞的增殖、分化和組織的發(fā)生發(fā)育、恒常性維持以及損傷修復(fù)過(guò)程中都具有重要的生理功能,近年隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)研究的不斷深入和突飛猛進(jìn)的發(fā)展,細(xì)胞外微環(huán)境的仿生構(gòu)建研究已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)以及材料學(xué)等多學(xué)科共同關(guān)注的焦點(diǎn)。仿生構(gòu)建具有良好生理與生化特性的細(xì)胞外微環(huán)境不僅可以在體內(nèi)外為細(xì)胞提供三維生長(zhǎng)空間,同時(shí)其還可進(jìn)一步參與調(diào)控細(xì)胞的表型表達(dá)及其結(jié)構(gòu)/功能重建。本論文工作旨在依據(jù)生物學(xué)信息、利用材料學(xué)分子設(shè)計(jì)及靜電紡絲成型加

2、工技術(shù)仿生構(gòu)建具有納米纖維結(jié)構(gòu)的三維多孔支架,系統(tǒng)研究了支架本體及表面結(jié)構(gòu)、組成等物理、化學(xué)和生物學(xué)信號(hào)分子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞/干細(xì)胞的黏附、增殖及誘導(dǎo)分化功能表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,并進(jìn)一步開(kāi)發(fā)具有特異性組織誘導(dǎo)功能的新型生物活性材料,為組織工程和再生醫(yī)學(xué)相關(guān)的細(xì)胞外微環(huán)境的仿生構(gòu)建提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。
　　 論文工作中首先通過(guò)提高靜電紡絲過(guò)程中接收轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速,制備了具有取向結(jié)構(gòu)納米纖維支架,并研究了其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及表面生物親和修飾對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增

3、殖及分化功能表達(dá)等細(xì)胞行為的影響。掃描電鏡(SEM)觀察結(jié)果顯示納米纖維的取向結(jié)構(gòu)整齊均一,且內(nèi)皮細(xì)胞特異親和性透明質(zhì)酸的表面修飾未明顯改變?nèi)∠蚣{米纖維支架的物理結(jié)構(gòu)。同時(shí),傅立葉紅外光譜分析表明低分子量的透明質(zhì)酸共價(jià)接枝到了經(jīng)氨解的聚己內(nèi)酯(PCL)納米纖維表面;該修飾使取向納米纖維支架的表面接觸角由105.2°變?yōu)?9.3°,顯著提高了支架表面的親水性。該支架進(jìn)一步用于內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng),其細(xì)胞形態(tài)分析結(jié)果表明,取向的納米拓?fù)湫螒B(tài)可顯著促

4、進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的伸展,其表面的透明質(zhì)酸改性可促進(jìn)細(xì)胞的粘附。血管性血友病因子(vWF)的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明透明質(zhì)酸修飾取向納米纖維支架更有利于促進(jìn)內(nèi)皮功能性基因的表達(dá)并快速誘導(dǎo)類內(nèi)皮層結(jié)構(gòu)形成。
　　 論文中還制備了控釋血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的梯度納米纖維(gCS/PCL)支架,進(jìn)一步研究該控釋體系對(duì)支架表面內(nèi)皮化的影響。通過(guò)殼聚糖/聚己內(nèi)酯質(zhì)量梯度靜電共紡技術(shù)制備殼聚糖梯度納米纖維支架,后經(jīng)共價(jià)鍵制

5、備梯度肝素化納米纖維支架,最終經(jīng)生物親和力進(jìn)一步制備VEGF的梯度分布及其緩慢釋放。本研究中利用熒光共聚焦顯微鏡、傅立葉紅外光譜分析、ELESA檢測(cè)及血小板黏附和抗凝血酶原時(shí)間測(cè)定等表征了所制備支架的理化學(xué)特性。結(jié)果表明,納米纖維支架基質(zhì)組分殼聚糖的梯度分布不僅提高了支架的肝素化程度,顯著抑制血小板的黏附,改善了制假的抗凝血性能;同時(shí)實(shí)現(xiàn)了支架表面VEGF的生物親和固定,與非梯度納米纖維支架相比,在釋放試驗(yàn)的最初12小時(shí)內(nèi),VEGF的突

6、釋現(xiàn)象明顯被改善,可持續(xù)有效釋放VEGF近1周。且內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞骨架熒光染色實(shí)驗(yàn)表明,裝載VEGF的梯度納米纖維支架更有助于HUVECs的粘附和快速增殖,并形成致密的內(nèi)皮細(xì)胞層。
　　 論文的最后一部分工作是為仿生構(gòu)建細(xì)胞微環(huán)境,通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建了內(nèi)皮細(xì)胞特異親和性融合蛋白細(xì)胞外基質(zhì)-VE-cad-Fc。分離擴(kuò)增內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素胞外域并與免疫球蛋白Fc段進(jìn)行基因融合構(gòu)建了真核表達(dá)載體,通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染、蛋白表達(dá)

7、和純化獲得VE-cad-Fc融合蛋白。Western blotting和ELEAS檢測(cè)表明我們不僅成功生物合成了VE-cad-Fc融合蛋白,其分子質(zhì)量約為90.3KD,且該融合蛋白均以二聚體的形式存在。VE-cad-Fc基質(zhì)化表面培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞,MTT和細(xì)胞骨架熒光染色結(jié)果表明,VE-cad-Fc融合蛋白可顯有促進(jìn)細(xì)胞的粘附和伸展,且其細(xì)胞黏附具有鈣離子依賴性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR基因表達(dá)分析顯示,VE-cad-Fc融合蛋白基質(zhì)上調(diào)細(xì)胞表面