中國(guó)腎移植患者環(huán)孢素的遺傳藥理學(xué)研究.pdf

1、第一部分：MDR1、CYP3A4與CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)環(huán)孢素藥動(dòng)學(xué)的影響
　　 背景與目的：
　　 腎臟移植是終末期腎病的首要選擇，在過去的幾十年中，腎移植受體和移植物的存活率有了顯著提高，這主要?dú)w功于高效免疫抑制劑，特別是環(huán)孢素A(cyclosporine A，CsA)在腎移植中合理應(yīng)用。但CsA具有個(gè)體間及個(gè)體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)差異大、治療窗窄的特點(diǎn)，臨床上需要對(duì)其進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)，從而降低排斥反應(yīng)及不良反應(yīng)的發(fā)生，提

2、高移植腎的存活率。CsA是P450酶系CYP3A(Cytochrome P4503A，CYP3A)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的底物，CYP3A基因及P-糖蛋白的編碼基因多藥耐藥(Multidrug resistance1，MDR1)基因具有多態(tài)性。我們推測(cè)其多態(tài)性可能是導(dǎo)致CsA藥動(dòng)學(xué)個(gè)體差異的原因之一。本研究的目的即是考察CYP3A4*1G、CYP3A5*3和MDR1基因多態(tài)性對(duì)中國(guó)腎移植患者術(shù)后不

3、同時(shí)間CsA藥動(dòng)學(xué)的影響。
　　 方法：
　　 選取以CsA+嗎替麥考酚酯+糖皮質(zhì)激素為基礎(chǔ)免疫抑制劑治療的132例中國(guó)漢族腎移植患者。采用聚合酶鏈反應(yīng)--限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Polymerasechain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)測(cè)定患者M(jìn)DR1 C1236T、G2677T/A、C3435T基因型，聚合酶鏈反應(yīng)--連接酶檢測(cè)

4、反應(yīng)(Polymerase chain reaction-ligase detection reaction，PCR-LDR)測(cè)定患者CYP3A4*1G及CYP3A5*3基因型。CsA全血谷濃度(服藥前濃度，C0)及峰濃度(服藥后2小時(shí)濃度，C2)采用熒光偏振免疫分析法測(cè)定，并以CsA濃度/(日劑量/體重)為校正濃度，采用單因素分析法(ANOVA或Kruskal-Wallis H檢驗(yàn))和多元線性回歸法，考察基因多態(tài)性及性別、隨訪年齡、紅

5、細(xì)胞比容(hematocrit，HCT)、血清肌酐(serum creatinine，Scr)、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、血清白蛋白(serum albumin，ALB)等臨床混雜因素對(duì)腎移植患者術(shù)后不同時(shí)間(術(shù)后0-7天、8-15天、16-30天、2-12個(gè)月及1年以上)CsA校正濃度的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.基因型分布情況
　　 132例腎移植患者中，MDR1

6、1236T、MDR12677T、MDR12677A、MDR13435T、CYP3A4*1G和CYP3A5*3的頻率分別為64.8％、39.4％、15.5％、37.5％、22.3％及74.2％。連鎖分析顯示CYP3A4*1G與CYP3A5*3存在較高程度的連鎖，D’值為0.83，其他位點(diǎn)之間連鎖程度較低。CYP3A4*1G與CYP3A5*3單倍體構(gòu)建的結(jié)果顯示：GG型為71.5％，AA型為19.5％，而AG和GA型分別為2.8％和6.2％

7、。
　　 2.單位點(diǎn)分析
　　 單因素分析顯示MDR1 C1236T與移植術(shù)后8-15天CsA的谷濃度及術(shù)后1年以上的峰濃度及谷濃度相關(guān)。MDR1 G2677T/A與移植術(shù)后1年以上峰濃度及谷濃度相關(guān)。MDR1 C3435T則與術(shù)后16-30天的峰濃度及術(shù)后1年以上峰谷濃度相關(guān)。CYP3A4*1G影響移植術(shù)后1個(gè)月以后峰濃度及谷濃度。CYP3A5*3與術(shù)后1個(gè)月以后的峰谷濃度相關(guān)。
　　 應(yīng)用多重線性回歸的方法，

8、考察引入多個(gè)臨床協(xié)變量后，基因多態(tài)性對(duì)CsA濃度的影響。結(jié)果與單因素分析有較大差別，MDR1 C1236T與移植術(shù)后1-15天CsA的谷濃度及術(shù)后1年以上的峰濃度相關(guān)。MDR1 G2677T/A與移植術(shù)后1年以上峰濃度及術(shù)后16天至1年的谷濃度相關(guān)。MDR1 C3435T則與術(shù)后16-30天和1年以后的谷濃度以及8-30天的峰濃度相關(guān)。CYP3A4*1G影響移植術(shù)后1年以后的谷濃度以及8天以后的峰濃度。CYP3A5*3只與術(shù)后1年以后的

9、谷濃度相關(guān)。結(jié)果總結(jié)見表2。
　　 3.CYP3A4/5聯(lián)合分析
　　 CYP3A4*1G-CYP3A5*3聯(lián)合基因型影響患者術(shù)后1年以后校正谷濃度與峰濃度，亦影響術(shù)后1年以內(nèi)的峰濃度，結(jié)果總結(jié)見表2。CYP3A4/5 AA-AA型患者校正濃度低于GG-GG型患者：術(shù)后1年以后，GG-GG型的谷濃度平均為28.67mg/ml，而AA-AA型為8.19 mg/ml，較GG-GG型低約70％；GG-GG型的峰濃度平均為202

10、.10 mg/ml，而AA-AA型為127.65 mg/ml，較GG-GG型低約37％。但多重線性回歸分析顯示各模型校正R平方均<20％，因此可解釋總變異的比例較低。
　　 4.MDR1與CYP3A聯(lián)合分析
　　 采用多重線性回歸，分析CYP3A4/5聯(lián)合基因型與MDR1聯(lián)合基因型對(duì)CsA血藥濃度的共同影響。CYP3A4/5聯(lián)合基因型與MDR1聯(lián)合基因型進(jìn)入同一回歸模型中。結(jié)果顯示CYP3A4/5影響術(shù)后1個(gè)月以后的峰濃

11、度及谷濃度，與1個(gè)月以內(nèi)的谷濃度亦呈相關(guān)性。而MDR1只影響移植術(shù)后1年以后的谷濃度，結(jié)果總結(jié)見表3。多重線性回歸模型顯示，在術(shù)后1年以后，MDR1與CYP3A4/5基因總變異可解釋CsA谷濃度個(gè)體間總變異的36.3％，峰濃度的12.9％。
　　 5.非遺傳學(xué)因素對(duì)CsA代謝的影響年齡、HCT、ALT、Scr分別在不同的時(shí)間影響CsA的谷濃度與峰濃度。ALB與性別因素對(duì)CsA的濃度影響相對(duì)較小。
　　 結(jié)論：
　　

12、 CYP3A4*1G與CYP3A5*3影響CsA的谷濃度及術(shù)后1個(gè)月以后的峰濃度，MDR1只對(duì)移植術(shù)后穩(wěn)定期(1年以后)的谷濃度有影響，對(duì)峰濃度沒有影響。MDR1與CYP3A4/5單獨(dú)都難以解釋CsA濃度個(gè)體差異，但MDR1與CYP3A4/5共同遺傳變異可解釋腎移植術(shù)后1年以后CsA谷濃度個(gè)體差異的36.3％，峰濃度的12.9％。腎移植術(shù)后CsA濃度個(gè)體差異的原因不僅與遺傳變異有關(guān)，還受到年齡、紅細(xì)胞比容和肝腎功能等非遺傳因素的影響。

13、本研究結(jié)果在一定程度上可解釋腎移植術(shù)后CsA濃度個(gè)體間差異的原因。
　　 第二部分：MDR1、CYP3A4、CYP3A5及FOXP3基因多態(tài)性對(duì)環(huán)孢素藥效學(xué)的影響
　　 背景與目的：
　　 CsA不僅藥動(dòng)學(xué)個(gè)體差異大，藥效學(xué)亦表現(xiàn)出較大的個(gè)體差異，即相同的血藥濃度可能會(huì)導(dǎo)致不同的藥物效應(yīng)。目前，臨床上主要對(duì)CsA血藥濃度進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)，并探索藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及相關(guān)代謝酶遺傳多態(tài)性對(duì)其藥動(dòng)學(xué)的影響，較少對(duì)其藥效學(xué)及影

14、響因素的評(píng)價(jià)和監(jiān)測(cè)。本研究在考察CYP3A4*1G、CYP3A5*3和MDR1 C1236T、G2677T/A、C3435T多態(tài)性對(duì)CsA藥動(dòng)學(xué)的影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索其對(duì)CsA藥效學(xué)的影響。
　　 CsA通過抑制IL-2的產(chǎn)生，不僅抑制輔助性T細(xì)胞的活化，而且抑制了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)。FOXP3是Treg的管家基因，其表達(dá)與Treg的功能及腎移植患者排斥反應(yīng)相關(guān)。FOXP3基因具有多

15、態(tài)性，其中啟動(dòng)子區(qū)域的rs3761547(-3499 A/G)、rs3761548(-3279 A/C)與rs2232365(-924 A/G)在中國(guó)人中有較高的突變頻率。多項(xiàng)研究證明FOXP3基因突變與一些自身免疫性疾病的發(fā)病相關(guān)。但FOXP3基因多態(tài)性對(duì)腎移植患者CsA免疫抑制效應(yīng)的影響，目前國(guó)內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 因此，本部分研究的目的即是：探索CYP3A4*1G、CYP3A5*3、MDR1(C1236T、G2677

16、T/A和C3435T)以及FOXP3(rs3761547、rs3761548和rs2232365)基因多態(tài)性對(duì)中國(guó)腎移植患者CsA免疫抑制效應(yīng)(預(yù)防排斥反應(yīng))的影響。
　　 方法：
　　 131例接受CsA+嗎替麥考酚酯+糖皮質(zhì)激素作為基礎(chǔ)免疫抑制治療的中國(guó)漢族腎移植患者，根據(jù)排斥反應(yīng)發(fā)生與否，分為排斥組(58例)和未排斥組(73例)。所有排斥反應(yīng)，均經(jīng)過腎穿刺后病理證實(shí)，根據(jù)Banff05分級(jí)，分為抗體介導(dǎo)的急性排斥反

17、應(yīng)，T細(xì)胞介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)、抗體介導(dǎo)的慢性排斥反應(yīng)、T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性排斥反應(yīng)。FOXP3 rs3761547、rs3761548與rs2232365基因型采用Taqman探針法測(cè)定。采用Binary logistic回歸比較不同基因型患者移植術(shù)后1年、2年、3年及5年的移植排斥發(fā)生率。應(yīng)用Kaplan-Meier分析及l(fā)og-rank檢驗(yàn)進(jìn)行事件史分析(生存分析)，移植術(shù)后第一次排斥反應(yīng)被定義為事件，發(fā)生時(shí)間定義為生存時(shí)間。Cox回歸

18、分析考察基因變異及臨床非基因組因素(包括CsA濃度、年齡、性別、身高、誘導(dǎo)治療及器官來(lái)源)對(duì)患者總排斥率的影響。進(jìn)一步采用Kaplan-Meier分析考察基因變異對(duì)急性T細(xì)胞介導(dǎo)排斥反應(yīng)發(fā)生的影響(移植術(shù)后第一次急性T細(xì)胞介導(dǎo)排斥反應(yīng)，定義為事件)。
　　 結(jié)果：
　　 1.基本資料及CsA血藥濃度
　　 排斥組和未排斥組患者年齡、性別、體重、身高、冷缺血時(shí)間、是否應(yīng)用誘導(dǎo)治療、器官來(lái)源(尸體供腎或活體供腎)及術(shù)

19、后1個(gè)月、1年、2年、3年和5年的CsA血藥濃度，均無(wú)明顯差異。
　　 2.基因型分布
　　 在131例中國(guó)漢族腎移植患者中，F(xiàn)OXP3基因rs3761547 G、rs3761548 C和rs2232365 G的發(fā)生頻率分別為13.4％、83.6％和24.8％。連鎖分析顯示rs3761547與rs3761548，rs3761547與rs2232365，rs3761548與rs2232365之間，D’分別為0.99，0.9

20、6和0.57。rs3761547-rs3761548-rs2232365單倍體頻率：ACA型為70.2％，GCG型為13.0％，AAG型為11.8％，AAA和GCA分別為4.6％和0.4％。
　　 3.Binary logistic回歸分析
　　 在腎移植術(shù)后1年、2年、3年及5年內(nèi)，分別有41例、52例、54例和55例患者發(fā)生了排斥反應(yīng)，另外有3例患者在移植術(shù)后5年以后發(fā)生了排斥反應(yīng)。CYP3A4*1G、CYP3A5*

21、3、MDR1基因C1236T、G2677T/A、C3435T及FOXP3基因rs3761547、rs2232365不同基因型患者排斥發(fā)生率，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。而rs3761548的多態(tài)性則對(duì)腎移植排斥發(fā)生率有顯著影響。在術(shù)后1年內(nèi)，攜帶有rs3761548 AA型患者，發(fā)生排斥的概率是CC患者的3.79倍(95％CI：1.11-12.95，P=0.034)，術(shù)后2年內(nèi)，AA型是CC型的5.82倍(95％CI：1.48-15.

22、93，P=0.012)，術(shù)后3年內(nèi)，從型是CC型的5.33倍(95％CI：1.36-14.97，P=0.017)，術(shù)后5年內(nèi)，AA型是CC型的5.11倍(95％CI.1.30-14.07，P=0.019)。
　　 4.Kaplan-Meier及Cox回歸分析
　　 Kaplan-Meier分析顯示rs3761548對(duì)腎移植排斥反應(yīng)的發(fā)生有顯著影響，AA型患者腎移植術(shù)后發(fā)生首次排斥反應(yīng)的時(shí)間要早于CC型患者(Log ran

23、k=6.952，P=0.031)，AA型與CC型患者發(fā)生排斥反應(yīng)的時(shí)間分別是術(shù)后35.71±14.50月和73.18±6.00月。應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型顯示，在引入其他各混雜因素后，rs3761548多態(tài)性依然顯著影響腎移植排斥反應(yīng)的發(fā)生(HR2.70，95％CI1.22-5.96，P=0.014)。聯(lián)合基因型分析顯示3761547-3761548 AA-AA型患者發(fā)生排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)比是AG-CC型患者的2.83倍(95％CI1.22-

24、6.58，P=0.016)。而CYP3A4、CYP3A5、MDR1及FOXP3 rs3761547、rs2232365多態(tài)性對(duì)腎移植排斥反應(yīng)的發(fā)生沒有顯著影響。非基因組因素對(duì)排斥發(fā)影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 以急性T細(xì)胞介導(dǎo)排斥反應(yīng)作為終點(diǎn)事件，進(jìn)行Kaplan-Meier分析，結(jié)果顯示只有rs3761548多態(tài)性與急性T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥發(fā)生密切相關(guān)(LogRank=7.853，P=0.020)，而CYP3A4*1G、CYP3A5*

25、3、MDR1及FOXP3 rs3761547與rs2232365，均對(duì)急性T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥發(fā)生無(wú)顯著影響。
　　 結(jié)論：
　　 CYP3A4*1G、CYP3A5*3、MDR1(C1236T、G2677T/A、C3435T)及FOXP3(rs3761547及rs2232365)多態(tài)性對(duì)CsA抑制排斥反應(yīng)無(wú)明顯影響，而FOXP3rs3761548位點(diǎn)的基因多態(tài)性與CsA抑制排斥反應(yīng)的療效密切相關(guān)。在給予CsA進(jìn)行基礎(chǔ)治療的中