HCV非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白在復(fù)制和感染中的作用.pdf

1、一、JFH1 NS5A基因置換對FL-J6JFH1復(fù)制和感染的影響 以我國HCV最主要基因型(1b型J4株)的NS5A替換FL-J6JFH的相應(yīng)基因得到嵌合型FL-J6JFH/J4NS5A，與野生型FL-J6JFH1，以及復(fù)制缺陷型陰性對照FL-J6JFH(GND)線性化后體外轉(zhuǎn)錄成RNA，用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染Huh-7.5.1細胞。比較三者轉(zhuǎn)染細胞在培養(yǎng)過程中HCV RNA水平差異。轉(zhuǎn)染后第5，8，12天抽提細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成

2、cDNA后作為模板，以HCV特異的熒光定量PCR(FQ RT-PCR)檢測細胞內(nèi)HCV的RNA水平。結(jié)果顯示，在檢測的三個時間點上嵌合體轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HCV RNA水平一直低于野生型轉(zhuǎn)染的細胞。在第5天，F(xiàn)L-J6JFH轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HCVRNA為1.1×106 GE/gg RNA，第8天，下降到9.5x105GE/μtg RNA，此后RNA水平明顯上升，第12天上升到4.6×106 GE/μg RNA。而嵌合體FL-J6JFH/J4NS5A的

3、HCVRNA水平則維持在一個較低且穩(wěn)定的水平(104 GE/μg RNA以上)。陰性對照FL-J6JFH(GND)轉(zhuǎn)染細胞后HCV RNA很快被宿主細胞清除。以丙型肝炎患者血清為一抗，免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HCV蛋白的表達，在第3、5、8和12天FL-J6JFH1和FL-J6JFH/J4NS5A轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)都可以檢測到HCV蛋白表達，F(xiàn)L-J6JFH/J4NS5A轉(zhuǎn)染細胞的熒光強度要顯著低于野生型FL-J6JFH轉(zhuǎn)染細胞，而對照的FL-

4、J6JFH(GND)轉(zhuǎn)染則沒有檢測到HCV蛋白陽性細胞。上述結(jié)果表明，野生型FL-J6JFH和NS5A置換后的FL-J6JFH/J4NS5A都能在Huh7.5.1細胞中長時間有效復(fù)制，F(xiàn)L-J6JFH/J4NS5A的復(fù)制能力較野生型有很大程度降低。收集FL-J6JFH/J4NS5A和FL-J6JFH轉(zhuǎn)染細胞的上清(d3、d5、d8、d12)，感染naive Huh-7.5.1細胞，72h后免疫熒光法檢測HCV蛋白陽性細胞，結(jié)果都可見HC

5、V蛋白的表達，但FL-J6JFH/J4NS5A的蛋白表達水平要顯著低于野生型FL-J6JFH。上述結(jié)果表明，F(xiàn)L-J6JFH和FL-J6JFH/J4NS5A轉(zhuǎn)染細胞后，都能產(chǎn)生具有感染性的病毒顆粒(HCVcc)。不同的是，F(xiàn)L-J6JFH NS5A被置換后，病毒的復(fù)制、蛋白的翻譯以及感染性病毒顆粒的分泌都顯著降低，說明了JFH NS5A在FL-J6JFH體外高效復(fù)制中起重要作用。 二、NS5A定點突變對置換后HCV復(fù)制能力下降的

6、代償作用 采用人工定點突變的方法，將HCV NS5A的2197位上的絲氨酸突變成脯氨酸(Ser-Pro)，2201位上絲氨酸缺失(deletion)，和2204位上的絲氨酸突變成異亮氨酸(Ser-Ile)，構(gòu)建四個突變復(fù)制子，即FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P)、FL-J6JFH/J4NS5A(S2201del)、FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2201del)和FL-J6JFH/J4NS5A(S21

7、97P+S2204I)。將四個突變子和未突變的FL-J6JFH/J4NS5A體外轉(zhuǎn)錄后分別轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細胞，轉(zhuǎn)染后第10天收集細胞進行RNA和蛋白檢測。用HCV特異性引物進行PCR定性檢測，在轉(zhuǎn)染后第10天所有的復(fù)制子都檢測到了特異性大小的HCV條帶。以Semi-FQ RT-PCR比較突變前后復(fù)制子轉(zhuǎn)染細胞在培養(yǎng)過程中HCVRNA表達水平的差異。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后FL-J6JFH/J4NS5A(S2201del)和FL-J6JFH

8、/J4NS5A(S2197P+S2204I)的HCV RNA水平都有顯著的升高，最高的為FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2204I)，為突變前的FL-J6JFH/J4NS5A RNA水平的800％，而FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P)和FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2201del)的RNA水平則有所降低，但幅度不大，均保持在突變前FL-J6JFH/J4NS5A RNA水平的85％以上。轉(zhuǎn)染后

9、第5和第8天收集細胞，熒光定量PCR檢測突變前后復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HCVRNA的水平。FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2204I)和FL-J6JFH/J4NS5A(S2201del)轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)RNA水平相較突變前有了提高。RNA水平最高組為FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2204I)，第8天細胞內(nèi)RNA水平為5.3×105GE/ug RNA，為突變前FL-J6JFH/J4NS5A第8天細胞內(nèi)RNA水平

10、的約120倍(4.2x104GE/ug RNA)。FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P)和FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2201del)與突變前相比，細胞內(nèi)RNA水平有所下降，其中最低為FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2201del)，轉(zhuǎn)染細胞后第8天，為3.3×103GE/ug RNA，約為RNA水平最高組的1/160。免疫熒光染色檢測轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HCV NS5A蛋白的表達情況，與突變前FL-J

11、6JFH/J4NS5A相比，突變后的FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P)和FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+2201del)的HCV陽性細胞數(shù)明顯減少，最少的為FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+2201del)，在轉(zhuǎn)染后第5天和第10天，幾乎不可見陽性細胞。 三、Core區(qū)基因能置換對FL-J6JFH病毒復(fù)制影響的研究 采用基因置換的方法(Gene swapping)，用我國HCV感染最

12、常見的基因型(1b型J4株)的core區(qū)基因替換了FL-J6JFH的相應(yīng)基因，構(gòu)建基因型間嵌合體FL-J6JFH/J4core。將FL-J6JFH1、FL-J6JFH/J4NS5A和FL-J6JFH/J4core用Xball線性化后，體外轉(zhuǎn)錄成RNA，用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細胞。轉(zhuǎn)染細胞傳代培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后第5天用FQ RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HCV RNA水平。結(jié)果表明，F(xiàn)L-J6JFH/J4core的RNA水平約為5.6

13、×105GE/ug RNA，與野生型FL-J6JFH1相當(dāng)，而FL-J6JFH/J4NS5A轉(zhuǎn)染后第5天細胞內(nèi)RNA水平僅為4.3×104GE/ug RNA。轉(zhuǎn)染后第8天，免疫熒光檢測HCV陽性細胞，野生型FL-J6JFH1的陽性細胞數(shù)在細胞總數(shù)中的比例達到了50％，而FL-J6JFH/J4core的值約為30％多，低于core置換前的野生型FL-J6JFH1株的水平。RNA轉(zhuǎn)染的細胞第8天陽性細胞數(shù)比例最少的是FL-J6JFH/J4N

14、S5A，不足5％左右，提示結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物之間的相互作用，會影響HCV的復(fù)制水平。與對照FL-J6JFH1相比，F(xiàn)L-J6JFH/J4core的陽性細胞數(shù)有了一定程度上的減少。 四、包膜區(qū)替換對HCV細胞親嗜性影響的研究 生長致密的單層BHK-21細胞按0.001MOI接種乙型腦炎病毒(JEV)疫苗株SAl4-14-2，培養(yǎng)72h左右至細胞發(fā)生明顯的病變效應(yīng)(CPE)，用JEV E單抗免疫熒光檢測，結(jié)果陽性細胞數(shù)

15、占總細胞數(shù)的接近70％。收集感染細胞的上清，抽提RNA后，用RT-PCR的方法，擴增出包含JEV prM和E區(qū)基因的片段。再用重疊延伸PCR、酶切連接等方法，平行替換同屬黃熱病毒HCV2a型FL-J6JFH的E區(qū)，構(gòu)建了HCV/JEV嵌合復(fù)制子。HCV/JEV嵌合子體外轉(zhuǎn)錄，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，免疫熒光檢測證實嵌合病毒HCV/JEV能在BHK-21細胞中表達蛋白，RT-PCR檢測證實轉(zhuǎn)染細胞中有病毒RNA的復(fù)制。嵌合病毒的蛋白

16、表達和RNA復(fù)制水平明顯低于J6JFH1病毒。 小結(jié)： 1．與野生型FL-J6JFH相比，F(xiàn)L-J6JFH/J4NS5A的復(fù)制能力顯著降低，表明NS5A是影響HCV復(fù)制的重要因子。FL-J6JFH/J4NS5A轉(zhuǎn)染細胞后不發(fā)生細胞病變效應(yīng)，可能更加接近天然存在的HCV，可以作為進一步研究影響HCV NS5A的關(guān)鍵決定因子的實驗平臺。 2．采用人工定點突變的方法，構(gòu)建HCV NS5A上氨基酸替換或缺失的四個突變復(fù)制

17、子，即FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P)、FL-J6JFH/J4NS5A(S2201del)、FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2201del)和FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2204I)。比較4個突變子與FL-J6JFH/J4NS5A在細胞內(nèi)復(fù)制水平的差異，發(fā)現(xiàn)了高復(fù)制能力的FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2204I)，說明關(guān)鍵氨基酸的替換能夠有效對NS5A置換后復(fù)制能力的下

18、降起到一定的代償作用。 3．用J4 core平行替換野生型的FL-J6JFHl，得到了FL-J6JFHH4core復(fù)制子，并對其在Huh7.5.1細胞內(nèi)復(fù)制、翻譯水平以及產(chǎn)生感染性病毒顆粒能力的改變進行了探討。 4．用同屬黃熱病毒的乙型腦炎病毒的prM和E區(qū)(決定細胞親嗜性)，平行替換HCV2a型FL-J6JFH1的E基因，構(gòu)建了嵌合的HCV/JEV復(fù)制子，并對其在BHK-21細胞內(nèi)的復(fù)制和蛋白表達進行了檢測，為建立HC