整合非靶標(biāo)和靶標(biāo)代謝組學(xué)模式的白念珠菌被膜形成及藥物干預(yù)機(jī)制研究.pdf

1、白念珠菌（Candida albicans）是一種常見的條件致病型真菌，可通過多種機(jī)制對(duì)人體的免疫系統(tǒng)及各種抗真菌藥物產(chǎn)生極大的耐受作用，使白念珠菌感染的治療一直是臨床上棘手的難題。
　　 近年來，代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為表征真菌代謝物調(diào)控模式提供了有力手段，并已應(yīng)用于白念珠菌代謝輪廓的分析。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸代謝作為代謝通路調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，在白念珠菌形態(tài)變化過程中扮演關(guān)鍵角色。本研究在此基礎(chǔ)上，聯(lián)合液質(zhì)聯(lián)用和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)

2、，構(gòu)建了靶標(biāo)和非靶標(biāo)代謝物分析方法，并結(jié)合代謝組學(xué)數(shù)據(jù)挖掘和藥理效應(yīng)驗(yàn)證等手段對(duì)白念珠菌形態(tài)變化以及中藥活性單體的抗菌藥效機(jī)制進(jìn)行了研究，旨在為真菌代謝組學(xué)相關(guān)研究提供方法參考。
　　 針對(duì)氨基酸的極性和質(zhì)譜響應(yīng)特征，構(gòu)建以多孔石墨碳柱為載體的離子對(duì)色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)（IP-PGC-TOF/MS），在基質(zhì)效應(yīng)、精密度、重復(fù)性、回收率、穩(wěn)定性考察的基礎(chǔ)上，利用三種同位素標(biāo)記的氨基酸內(nèi)標(biāo)，建立了白念珠菌中22種關(guān)鍵氨基酸的非衍

3、生化定量分析方法，最低檢測(cè)限和最低定量限均達(dá)到納克級(jí)。此方法的建立為后續(xù)的白念珠菌靶標(biāo)與非靶標(biāo)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 以浮游型和被膜型白念珠菌為對(duì)象，在已有的GC-MS研究基礎(chǔ)上，為開展對(duì)極性不揮發(fā)代謝物的研究，應(yīng)用IP-PGC-TOF/MS方法，結(jié)合代謝指紋譜技術(shù)和定量代謝組學(xué)技術(shù)，針對(duì)白念珠菌的被膜形成機(jī)制進(jìn)行了更深入研究。在非靶標(biāo)研究發(fā)現(xiàn)16個(gè)差異代謝物的基礎(chǔ)上，通過對(duì)白念珠菌胞內(nèi)22種氨基酸的定量分析，精確刻畫了氨基酸的

4、代謝水平變化，發(fā)現(xiàn)了一系列和被膜形成相關(guān)的代謝生物標(biāo)志物，主要與鳥氨酸、賴氨酸代謝相關(guān)，其中鳥氨酸在生物被膜中明顯降低。進(jìn)一步通過鳥氨酸脫氫酶(ODC)基因敲除菌SPE1的代謝物活性測(cè)試和疏水性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了鳥氨酸代謝在生物被膜形成中的關(guān)鍵作用。
　　 我們將構(gòu)建的靶標(biāo)和非靶標(biāo)結(jié)合的代謝分析方法應(yīng)用于中藥抗菌活性單體黃芩素作用于白念珠菌的代謝調(diào)控機(jī)制研究。通過GC-MS與IP-PGC-TOF/MS代謝輪廓分析，分別篩選到20個(gè)和21

5、個(gè)黃芩素給藥相關(guān)的差異代謝物，主要參與糖酵解、應(yīng)激反應(yīng)、氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)、磷脂代謝、鞘脂代謝等通路，并完成對(duì)黃芩素給藥組和對(duì)照組胞內(nèi)22個(gè)氨基酸的定量，揭示了黃芩素可能通過干擾能量代謝，細(xì)胞膜功能以及對(duì)感應(yīng)分子合成的調(diào)節(jié)起到抗白念珠菌的作用。
　　 本論文探索構(gòu)建的靶標(biāo)與非靶標(biāo)結(jié)合的代謝組學(xué)研究模式成功運(yùn)用于白念珠菌的研究，相較于傳統(tǒng)研究策略，本方法體系具有更靈敏地代謝物識(shí)別能力以及更精確的定量能力，可為真菌形態(tài)變化和藥效