miR-96介導(dǎo)的FOXO3表達(dá)變化對肺腺癌細(xì)胞A549增殖和凋亡的影響.pdf

1、背景:
　　目前，在世界范圍內(nèi)，肺癌是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，它的病理類型主要分為兩種:一是進(jìn)展速度較快的小細(xì)胞癌(smallcelllungcarcinoma，SCLC)，占總體比例的13-15％左右，二是非小細(xì)胞癌(non-smallcelllungcarcinoma，NSCLC)，包括腺癌、鱗癌，大細(xì)胞癌，神經(jīng)內(nèi)分泌癌等，占總體比例的85％左右，其中腺癌是發(fā)病率最高的肺癌。導(dǎo)致肺癌預(yù)后較差的原因有很多方面，大部分患

2、者發(fā)現(xiàn)肺癌時已處于晚期是預(yù)后差的關(guān)鍵因素之一，因此早期發(fā)現(xiàn)和手術(shù)仍然是治療效果最好的措施。對于中晚期的肺癌患者，主要的治療手段有化學(xué)藥物治療、放射性治療、生物靶向治療等。這些治療手段有一定的療效，但患者耐受性差、副作用大、容易復(fù)發(fā)，特別是化學(xué)藥物治療、放射性治療。肺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移也是影響患者療效和生存時間的關(guān)鍵因素，明確的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制目前仍然不清楚，因此缺乏有效的治療手段。由于肺癌發(fā)病率高，預(yù)后差，目前缺乏有效的治療手段，積極探索肺癌

3、發(fā)發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制，對于早期診斷、減少復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，以及治療肺癌的新方新策略均具有現(xiàn)實意義。
　　微小RNA，即microRNA(miRNA)，是由22個左右的核糖核苷酸組成的非編碼、小分子單鏈RNA，在物種間和進(jìn)化上具有高度保守性，幾乎所有的真核細(xì)胞生物都可以表達(dá)。MicroRNA以完全或者不完全互補(bǔ)結(jié)合的方式與mRNA的3'端非編碼區(qū)(3'-UTR)相互作用，促進(jìn)mRNA降解，抑制mRNA翻譯。MicroRNA對很多基因都有調(diào)控

4、作用，在細(xì)胞的生長發(fā)育、分化、增殖、凋亡、細(xì)胞周期等細(xì)胞生物學(xué)行為都起著十分重要的作用。近年越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在很多腫瘤組織和腫瘤患者血清中，miRNA有過表達(dá)或者低表達(dá)的現(xiàn)象，并且繪制了不同腫瘤組織的miRNA表達(dá)譜。進(jìn)一步的研究表明，miRNA在肺瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用。miRNA-96是miRNA-183家族(miRNA-96，miRNA-182，miRNA-183)成員，在進(jìn)化上高度保守，位于人類7號染色上。FOX03

5、屬于FOX0s家族(Fox01，F(xiàn)ox03，F(xiàn)ox04andFox06)，這一類轉(zhuǎn)錄因子的特點是鮮明的叉頭DNA結(jié)合域。FOX03的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，癌癥中常見的是FOX03基因的下調(diào)，因此FOX03被稱為腫瘤抑制器。生物學(xué)信息分析FOX03的3'-UTR具有2個序列保守的miRNA-96的結(jié)合位點，結(jié)合后抑制FOX03的表達(dá)。在人乳腺癌組織中和乳腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)的miRNA-96通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子FOX03起到促進(jìn)腫

6、瘤細(xì)胞增殖的作用。在人肝細(xì)胞癌中miRNA-96的表達(dá)抑制可以增加FOX01、FOX03的表達(dá)水平，以此減少肝癌細(xì)胞系的增殖和集落形成。在非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcarcinoma，NSCLC)組織和相應(yīng)患者血清中，已有證實miRNA-96持續(xù)和顯著高表達(dá)。WangyuZhu等人利用70對NSCLC組織和相匹配的癌旁組織、44例正常人血清樣本，驗證了miRNA-183家族（包括miRNA-96）在癌組織中、患者血

7、清中高表達(dá)，并且在肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299、SPC-A1，肺小細(xì)胞癌細(xì)胞系NCI-H466，肺大細(xì)胞癌細(xì)胞系NCI-H460中表達(dá)增高。miRNA-96在NSCLC組織中及血清中研究報道較多，但在細(xì)胞水平及其下游作用靶點國內(nèi)外研究較少。
　　目的:
　　探討miRNA-96對人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖和凋亡能力的影響及其對FOX03的調(diào)控作用。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)及miRNA-96inhibit

8、or設(shè)計人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549用DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清培養(yǎng)，miRNA-96inhibitor由上海生工生物公司設(shè)計并合成。
　　2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)將miRNA-96inhibitor轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞內(nèi)。實驗分組三組:實驗組（miRNA-96inhibitor），對照組(scramble)，空白組(blank)。轉(zhuǎn)染后24～48小時后進(jìn)行相關(guān)實驗及指標(biāo)檢測。
　　3.指標(biāo)檢測采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-P

9、CR)技術(shù)檢測干擾后細(xì)胞內(nèi)FOX03mRNA的表達(dá)量，采用westernblotting技術(shù)檢測干擾后FOX03蛋白質(zhì)的表達(dá)量，CCK-8技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力，采用細(xì)胞劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡情況。
　　4.統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。該實驗采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:
　　1.轉(zhuǎn)染后，F(xiàn)OX03mRNA及FOX03蛋白質(zhì)表達(dá)量均顯著增高RT

10、-PCR結(jié)果顯示實驗組FOX03mRNA的表達(dá)量顯著高于對照組和空白組。Westernblotting結(jié)果顯示FOX03蛋白質(zhì)的表達(dá)量顯著高于對照組和空白組。
　　2.細(xì)胞遷移能力細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞遷移距離小于對照組和空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而對照組和空白組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　3.細(xì)胞增殖能力CCK-8試驗結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞增殖率顯著小于對照組和空白組，差異具有統(tǒng)計

11、學(xué)意義（P＜0.05），而對照組和空白組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　4.細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組和空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而對照組和空白組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.將特異性的miRNA—96inhibitor轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞內(nèi)，可促進(jìn)FOX03mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　2.FOX03表達(dá)上調(diào)后，A549的