人骨髓干細(xì)胞源性惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的靶向清除.pdf

1、背景：人類骨髓干細(xì)胞human bone marrow stem cells，hBMSC)移植給許多病人帶來了希望的同時也帶來了風(fēng)險。干細(xì)胞治療所帶來的所有風(fēng)險中，最嚴(yán)重而且最引人注目的是干細(xì)胞植入體內(nèi)后發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化而致腫瘤的形成。因而制定一個干細(xì)胞植入后的可控制策略就成了各干細(xì)胞研究團(tuán)隊和臨床醫(yī)學(xué)研究者迫在眉睫要解決的問題。然而，制定這樣的策略卻不可避免地面臨著許多挑戰(zhàn)，包括高效腫瘤組織特特異性啟動子的設(shè)計、獲取大量hBMSC源性惡轉(zhuǎn)

2、細(xì)胞用于啟動子的功能驗證及體內(nèi)外細(xì)胞毒性實驗、惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞異種移植成活率較低等。迄今為止仍然沒有一個切實可行的方法來預(yù)防移入hBMSC發(fā)生致瘤性轉(zhuǎn)化。
　　 目的：1.提高端粒酶啟動子在hBMSC源性惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)錄活性的順式修飾探討，獲取一種在端粒酶陽性細(xì)胞中具有高特異性和較強轉(zhuǎn)錄活性的hTERT啟動子，為下一步預(yù)防干細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化及靶向清除植入hBMSC源性惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞打下基礎(chǔ)；2.探尋一個在體外獲取足夠數(shù)量hBMSC

3、源性惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法；3.建立一個為預(yù)防植入hBMSC發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化以及靶向清除發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化研究模型。
　　 方法：
　　 1.c-Myc結(jié)合元件對hTERT啟動子的修飾：用化學(xué)合成方法在野生型hTERT(WThTERT)核心啟動子片段(編碼蛋白起始子ATG上游-268 bp～-10 bp)的3'端接入三個E-box序列，構(gòu)建成修飾型hTERT[Mod1hTERT)啟動子；分別用WThTERT和Mod1hTERT啟動子去

4、調(diào)控增強型綠色熒光蛋白(EGFP)及熒光素酶報告基因在293FT、HepGⅡ、SGC7901、U2OS(端粒酶陰性)、以及人骨髓干細(xì)胞(hBMSC)中表達(dá)，比較并分析不同啟動子在端粒酶陽性與陰性細(xì)胞中的表達(dá)強度。
　　 2.源于hBMSC的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的體外擴增：從骨髓中分離培養(yǎng)人骨髓干細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行表型鑒定；然后用慢病毒轉(zhuǎn)染和致瘤化學(xué)誘導(dǎo)劑BPDE處理共同誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化；用PALA進(jìn)行IC50篩選純化瘤變

5、細(xì)胞克??；最后再用PCR、RT-PCR、Western blot等方法對慢病毒轉(zhuǎn)染、細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行分析。
　　 3.下調(diào)hTERT啟動子在hBMSC中轉(zhuǎn)錄活性的修飾：在Mod1hTERT啟動子的上游接入4個骨髓鋅指蛋白-2(MZF-2)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件，形成新的修飾型啟動子命名為Mod2hTERT啟動子；分別從大腸桿菌K12和質(zhì)粒pEGFP-N3中通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成胞嘧啶轉(zhuǎn)氨酶(CD)基因和綠色熒光蛋白(EGF

6、P)基因；用化學(xué)合成法分別制備野生型hTERT、Mod1hTERT及Mod2hTERT啟動子；將EGFP和熒光素酶(luciferase)報告基因分別亞克隆入慢病毒載體pLenti6/V5-D-TOP中；將各啟動子片段取代pLenti6/V5-D-TOPO中的CMV啟動子片段；將重組慢病毒載體包裝成病毒顆粒后轉(zhuǎn)染正常人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSC)、慢病毒轉(zhuǎn)染及化學(xué)致瘤劑BPDE處理后的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BR-hBMSC)，以及PAL

7、A抗性的BR-hBMSC(PBR-hBMSC)；通過熒光相差顯微鏡觀察EGFP表達(dá)和熒光素酶分析kit檢測熒光素酶活性(luciferase activity)。
　　 4.5-FC對hBMSC源性惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞毒性實驗：分別用不同濃度梯度的5-FC來處理體外培養(yǎng)的轉(zhuǎn)入 WThTERT-luciferase-IRES-CD、Mod1hTERT-luciferase-IRES-CD、Mod2hTERT-luciferase-I

8、RES-CD、CMV-luciferase-IRES-CD及prmoter(lack)-luciferase-IRES-CD融合基因的各組PBR-hBMSC細(xì)胞；用MTT法在體外測定不同濃度梯度5-FC對各組PBR-hBMSC的細(xì)胞毒性；轉(zhuǎn)入WThTERT-luciferase-IRES-CD、Mod2hTERT-luciferase-IRES-CD、以及CMV-luciferase-IRES-CD的轉(zhuǎn)基因PBR-hBMSC植入裸鼠的皮

9、下一周后，腹腔注射5-FC5 mg/天，并用活體熒光成像系統(tǒng)對植入細(xì)胞的生長狀況進(jìn)行觀測。
　　 結(jié)果：
　　 1.c-Myc結(jié)合元件對hTERT啟動子的修飾：在Mod1hTERT啟動子的各實驗組細(xì)胞中，能夠在端粒酶陽性的293FT、HepGⅡ及SGC7901細(xì)胞組中觀測到EGFP的表達(dá)，而在端粒酶陰性的U2OS及hBMSC細(xì)胞組中沒有觀測到EGFP的表達(dá)；進(jìn)一步用熒光素酶活性對啟動子的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行定量分析表明，在端粒酶

10、陽性的293FT、HepGⅡ、SGC7901和U2OS細(xì)胞株中，Mod1hTERT啟動子調(diào)控下的熒光素酶活性要高于WThTERT啟動子組(P<0.01)，而在端粒酶陰性的原代人成纖維細(xì)胞hBMSC及骨肉瘤細(xì)胞U2OS細(xì)胞中，Mod1hTERT啟動子與WThTERT啟動子的轉(zhuǎn)錄活性無顯著性差別(P>0.05)。
　　 2.源于hBMSC惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的體外擴增：PCR結(jié)果表明，hBMSC在慢病毒介導(dǎo)下可以獲得外源的遺傳性表型；RT-

11、PCR檢測結(jié)果表明，細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因c-myc、bcl-2表達(dá)顯著上調(diào)(p<0.01)，p53及mzf-2則顯著下調(diào)(p<0.01)。
　　 3.下調(diào)hTERT啟動子在hBMSC中轉(zhuǎn)錄活性的修飾：通過熒光相差顯微鏡觀察結(jié)果表明，啟動子Mod1hTERT和Mod2hTERT在PBR-hBMSC(慢病毒轉(zhuǎn)染、BPDE處理后，具有PALA抗性的hBMSC)中的表達(dá)較強而在hBMSC和BR-hBMSC(慢病毒轉(zhuǎn)染hBMSC)中只有微

12、弱的表達(dá)；啟動子CMV驅(qū)動的EGFP基因在所有的細(xì)胞中都有很強的表達(dá)；Luciferase activity分析結(jié)果表明，在293FT及PBR-hBMSC細(xì)胞中，Mod1hTERT及Mod2hTERT啟動子的轉(zhuǎn)錄活性要顯著高于WT-hTERT啟動子的轉(zhuǎn)錄活性(Sig.<0.05)，而在hBMSC及BR-hBMSC(慢病毒轉(zhuǎn)染hBMSC)中，Mod2hTERT的轉(zhuǎn)錄活性得到了有效的抑制(Sig.<0.05)。
　　 4.5-FC對

13、hBMSC源性惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞毒性實驗：MTT實驗結(jié)果表明，當(dāng)5-FC濃度100μM時，在Mod1hTERT細(xì)胞組中存活細(xì)胞占5.79％，Mod2hTERT細(xì)胞組中占6.53％，CMV細(xì)胞組中只有1.97％的細(xì)胞存活；而在相同條件下實驗陰性對照組prmoter(lack)-luciferase-IRES-CD中，存活的細(xì)胞達(dá)到96.27％；活體熒光成像系統(tǒng)檢測結(jié)果表明，在給藥時間為O周時WThTERT-luciferase-IRES-

14、CD細(xì)胞組的最大熒光信號比Mod2-luciferase-IRES-CD細(xì)胞組及CMV-luciferase-IRES-CD細(xì)胞組低4.33及5.29倍；而給藥2至此周后，各組間的熒光信號強度差異不顯著。給藥4至周后，Mod2-luciferase-IRES-CD細(xì)胞組及CMV-luciferase-IRES-CD細(xì)胞組的熒光信號基本消失，WThTERT-luciferase-IRES-CD細(xì)胞組的熒光信號仍然存在。
　　 結(jié)論

15、：
　　 1.在hTERT核心啟動子的3'端增加E-box元件的數(shù)量可以提高h(yuǎn)TERT核心啟動子序列的腫瘤靶向轉(zhuǎn)錄活性。
　　 2.hBMSC在BPDE和慢病毒共同誘導(dǎo)后，用PALA的IC50篩選可以得到瘤變細(xì)胞克隆。
　　 3.野生型hTERT啟動子經(jīng)過c-Myc作用元件E-box進(jìn)行修飾后，可以有效提高h(yuǎn)TERT啟動子在端粒酶陽性細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性.而經(jīng)過修飾MZF-2結(jié)合位點修飾后，可以有效降低hTERT啟動