Angiopoietin-1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在HEK293細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的：構(gòu)建血管生成素-1基因真核表達(dá)載體pSecTag2B-Ang-1，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，并檢測(cè)其Ang-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平，為下一步冠心病的基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：根據(jù)已知人的Ang-1 cDNA序列，設(shè)計(jì)引物。以人心臟cDNA文庫(kù)的質(zhì)粒DNA為模板擴(kuò)增Ang-1 cDNA，并行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增出的目的基因通過(guò)回收、純化和酶切后與真核表達(dá)載體連接，再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α

2、，并在含氨芐青霉素的培養(yǎng)皿中挑選陽(yáng)性菌落，提取陽(yáng)性克隆重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和基因測(cè)序進(jìn)行鑒定。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)分為兩組：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞作為對(duì)照組。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)(Real-time Quantitative PCR Detecting System, QPCR)、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot, WB)方法檢

3、測(cè)其Ang-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建血管生成素-1基因真核表達(dá)載體。將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染到 HEK293細(xì)胞中，經(jīng) QPCR方法檢測(cè)示實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組中Ang-1mRNA的表達(dá)水平明顯升高（p<0.05）。Western Blot方法檢測(cè)示實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組中Ang-1蛋白表達(dá)水平顯著性增高（p<0.05）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞能高效并穩(wěn)定地表達(dá)Ang-1 mRNA和蛋白