鈣離子通道蛋白CACNA1C與DLBCL免疫化療療效相關(guān)機制的研究.pdf

1、背景
　　彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是最常見的一種侵襲性淋巴瘤，其治療和預后在過去10年取得了巨大的進步。雖然DLBCL有很多亞型，但其共同點就是腫瘤細胞高度表達CD20抗原?？笴D20單克隆抗體利妥昔單抗的出現(xiàn)被認為是B細胞淋巴瘤治療上的一個重大突破。大量臨床試驗證實，利妥昔單抗聯(lián)合CHOP的免疫化療方案(R-CHOP)明顯提高了DLBCL患者的緩解率和生存率。因此2003年NCCN治療指南將R-CHOP方案作為DLBCL

2、的一線標準治療方案。然而，對于部分患者，利妥昔單抗的應用并沒有增加CHOP方案的療效，而是表現(xiàn)出耐藥、早期或晚期復發(fā)。研究顯示，鈣通道和泵與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，鈣離子傳導通路在利妥昔單抗相關(guān)的細胞凋亡中也起重要作用，因為在被利妥昔單抗殺死的細胞中發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)鈣的增高。基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，在對免疫化療不同反應的患者中，存在鈣通道蛋白CACNA1C的差異性表達，因此鈣通道蛋白與免疫化療療效的關(guān)系值得深入研究。
　　目的
　　明

3、確CACNA1C與DLBCL患者免疫化療療效的關(guān)系，尋找提高其療效的方法。
　　材料與方法
　　選取2007-2012年鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院R-CHOP方案初治的DLBCL患者111例，收集臨床資料和病理科存檔的石蠟組織，根據(jù)療效，將其分為敏感組和耐藥組。選取DLBCL兩種細胞株OCI-Ly7和OCI-Ly3，其中OCI-Ly7是對利妥昔單抗敏感的細胞系，OCI-Ly3是對利妥昔單抗耐藥的細胞系。
　　1臨床研究部分<

4、br>　　選取DLBCL患者48例用來做預實驗基因芯片，基因表達譜結(jié)果分析，在耐藥組和敏感組中，鈣通道基因存在差異性表達，其中CACNA1C差異性較明顯，CD20表達無明顯差異。再選取DLBCL患者63例，敏感組41例，耐藥組22例。從石蠟組織中提取RNA，應用qRT-PCR方法檢測患者基因CACNA1C的表達量。應用免疫組化的方法分別檢測患者中CACNA1C和CD20的表達量。
　　2基礎(chǔ)研究部分
　　2.1應用CCK-8

5、法分別檢測利妥昔單抗、表阿霉素作用于兩種細胞株細胞增殖的情況。篩選出藥物的最佳作用濃度，為后期藥物實驗提供依據(jù)。
　　2.2分別應用qRT-PCR和WesternBlot方法檢測兩種細胞株中CACNA1C基因和蛋白的表達量。
　　2.3利用Indo1-AM流式細胞儀檢測利妥昔單抗加或不加鈣通道阻滯劑尼莫地平作用于兩種細胞系，鈣離子內(nèi)流情況。
　　2.4AnnexinV-FITC流式檢測利妥昔單抗和表阿霉素作用于兩種細胞

6、株的凋亡率，以及尼莫地平對細胞凋亡的影響。
　　3統(tǒng)計學方法
　　實驗結(jié)果所用到的統(tǒng)計分析均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。免疫組化實驗結(jié)果用平均值±標準差((x)±s)來表示，分別檢驗其正態(tài)性、方差齊性，采用t檢驗來比較差異。
　　結(jié)果
　　1.CACNA1C基因在敏感組患者中表達量高于耐藥組，差異有統(tǒng)計學意義(p=0.025)。CACNA1C蛋白在耐藥組患者中表達陽性率較敏感組低(10/22vs31/41，p=

7、O.021)，CD20在兩組中表達無明顯差異。
　　2.利妥昔單抗和表阿霉素分別作用兩種細胞株后，細胞增殖抑制率均呈濃度依賴性，和時間相關(guān)性不大，最佳作用濃度分別為利妥昔單抗50μg/ml，表阿霉素濃度50ng/ml。
　　3.在對利妥昔單抗敏感的細胞株OCI-Ly7中，CACNA1C基因的表達量明顯高于對利妥昔單抗耐藥的OCI-Ly3細胞株(19.617±1.627vs5.230-±0.120，P=0.001)。Weste

8、rnblot發(fā)現(xiàn)鈣通道蛋白CACNA1C在OCI-LY3細胞上的表達明顯低于OCI-Ly7細胞。
　　4.利妥昔單抗聯(lián)合Fab抗體后能誘導兩種細胞株的鈣內(nèi)流，且鈣內(nèi)流的強度能顯著地被尼莫地平所抑制，對OCI-Ly7細胞的抑制強度明顯強于OCI-Ly3細胞。
　　5.利妥昔單抗處理兩種細胞株48h，OCI-Ly7細胞較之OCI-Ly3細胞有較高的凋亡率;經(jīng)利妥昔單抗聯(lián)合表阿霉素處理48h后，尼莫地平能顯著降低兩種細胞株的凋亡: