溫度-pH響應(yīng)型磁性納米凝膠用于大鼠腦膠質(zhì)瘤MRI-熒光成像的研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，具有較高的惡性程度和死亡率，且其對腦功能的破壞導(dǎo)致嚴(yán)重的認知和情感障礙。目前手術(shù)仍是首選治療方法。但由于膠質(zhì)瘤細胞彌漫浸潤性的生長，手術(shù)中難以區(qū)分正常腦組織和腫瘤組織，經(jīng)常造成術(shù)后殘留腫瘤的復(fù)發(fā)，或者正常腦組織功能的喪失。完整切除腫瘤且不影響瘤床附近的腦關(guān)鍵結(jié)構(gòu)是腦膠質(zhì)瘤瘤手術(shù)的理想結(jié)果，其中的關(guān)鍵問題是如何對腦膠質(zhì)瘤進行清晰準(zhǔn)確的界定。為了在術(shù)前對腦膠質(zhì)瘤進行準(zhǔn)確定位和精細成像并在術(shù)中引導(dǎo)外科醫(yī)生區(qū)分正常

2、腦組織和腫瘤組織來提高腫瘤切除的精度，本研究利用聚（N-異丙基丙烯酰胺-co-丙烯酸）（PNA）納米凝膠的溫度/pH響應(yīng)性，負載Fe3O4納米材料，并偶聯(lián)腦腫瘤靶向配體（乳鐵蛋白）和近紅外熒光染料（Cy5.5）。對所構(gòu)建的Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的理化性質(zhì)、磁性能及MRI/光學(xué)成像性能進行了表征與評價；通過研究 Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的血清蛋白調(diào)理作用、巨噬細胞的吞噬行為、體內(nèi)血液循環(huán)過程、溫度/pH響應(yīng)性以及Lf

3、主動靶向性對細胞攝取的影響，對Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的體內(nèi)過程進行了初步探討；從體外成像和體內(nèi)成像兩方面考察了Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠對大鼠原位腦膠質(zhì)瘤的特異性成像特性；并分別考察了Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的體外和體內(nèi)毒性。研究中完成的主要工作包括：
　　(1)制備了Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠并對其進行表征。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法證實了Cy5.5-Lf偶聯(lián)至 MPNA納米凝膠。Cy5.

4、5-Lf-MPNA納米凝膠的平均粒徑為86.4±3.4nm（TEM），流體力學(xué)直徑為95.5±6.2nm，PDI為0.186，原子吸收光譜及熱重分析測定納米凝膠中 Fe3O4含量為38.7％。振動樣品磁強計（VSM）測定Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的磁飽和強度為61.1emu/g Fe。醫(yī)用磁共振成像儀（MRI，3T）測定其弛豫率（r2）為129.3mM-1s-1。納米凝膠在695nm處具有最大發(fā)射峰。采用動態(tài)光散射（DLS）和疏

5、水熒光探針（芘）技術(shù)對其粒徑、表面親疏水性隨溫度及pH的變化進行了表征。其粒徑隨溫度升高而降低，疏水性隨著溫度升高而增大，pH6.8時，體積相轉(zhuǎn)變溫度（VPTT）約為34℃， pH7.4時， VPTT約為40℃。
　　(2)選擇BSA和IgG作為代表性血清蛋白考察Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的蛋白調(diào)理作用。結(jié)果顯示pH7.4時，Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠表現(xiàn)為高度親水、溶脹，且ζ電位絕對值較低，BSA和 IgG的吸附

6、水平都較低；但 pH降低至6.8時， Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷畱B(tài)、粒徑收縮，且ζ電位絕對值增大，導(dǎo)致BSA和IgG的吸附水平顯著升高。而對照組材料Cy5.5-Lf-SPION不具有pH響應(yīng)性，兩個pH條件下BSA和IgG的吸附水平?jīng)]有顯著性差異。此外，pH7.4下，Cy5.5-Lf-SPION和Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的粒徑存在顯著性差異，且Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠表面具有高度柔性的納米凝膠層，具

7、有良好的變形性，在正常生理環(huán)境中表現(xiàn)為溶脹狀態(tài)，向外高度伸展，故其三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以有效阻礙蛋白與納米材料的接觸，所以與Cy5.5-Lf-SPION相比，BSA和IgG對Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的吸附水平較低。
　　(3)在巨噬細胞吞噬行為研究中，將Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠及對照材料用小鼠血清進行調(diào)理后，pH7.4時，巨噬細胞對Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的吞噬量為41.6μg Fe/106細胞，顯著低于對

8、Cy5.5-Lf-SPION的吞噬量（59.2μg Fe/106細胞），其結(jié)果與蛋白調(diào)理作用的研究結(jié)果相符。
　　(4)在溫度/pH響應(yīng)性對細胞攝取的影響的研究中，不同 pH條件下，C6細胞和ECV304細胞對Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的攝取都存在顯著性差異。pH6.8時，細胞攝取量顯著高于pH7.4下的攝取量。其中C6細胞對Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的攝取增加了30％，ECV304細胞對Cy5.5-Lf-MPNA

9、納米凝膠的攝取增加了50％。而對于不具有溫度/pH響應(yīng)性的Cy5.5-Lf-SPION和SPION，不同pH條件下，兩種細胞對材料的攝取量沒有明顯差異。
　　(5)在Lf偶聯(lián)對細胞攝取的影響研究中，C6細胞（LRP1表達陽性）在孵育濃度范圍（0-20μg Fe/mL）內(nèi)對Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的攝取量顯著高于 MPNA納米凝膠，且在較大濃度時，差異非常顯著（孵育濃度為15和20μg Fe/mL時，p <0.0

10、01）。而 ECV304細胞(LRP1表達陰性）在相同孵育濃度范圍內(nèi)對Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的攝取量與對MPNA納米凝膠的攝取量無顯著差異（p>0.05）。進一步證實了Lf靶向修飾可以提高 LRP1陽性細胞對偶聯(lián) Lf納米材料的攝取量。
　　(6)初步探討了Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的體內(nèi)靶向過程。Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠進入體內(nèi)后，在正常組織（血液）中是溶脹的親水狀態(tài)，ζ電位呈負值且絕對值較小，具備

11、長循環(huán)能力。到達腫瘤部位后，由于環(huán)境pH降低（pH6.5-6.8），Cy5.5-Lf-MPNA轉(zhuǎn)變?yōu)槭湛s的疏水狀態(tài)，這種改變以及靶向分子Lf的存在，有助于促進EPR效應(yīng)并增強與膠質(zhì)瘤細胞的相互作用。
　　(7) MRI/熒光成像方法考察Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠對腦膠質(zhì)瘤的特異性成像能力。結(jié)果表明，C6細胞可吞噬Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠，且Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠位于細胞漿；注射Cy5.5-Lf-MPN

12、A納米凝膠后荷瘤大鼠腫瘤部位信號降低，而注射 MPNA納米凝膠無任何肉眼可見的信號變化，且注射Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的腫瘤部位信號最大變化為82％；注射Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的荷瘤大鼠腫瘤部位觀察到明顯的熒光信號，且熒光信號勾勒出清晰的腦膠質(zhì)瘤區(qū)域；注射Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的荷瘤大鼠腫瘤組織中累積了大量可被普魯士藍染成藍色的鐵顆粒，而注射MPNA納米凝膠的荷瘤大鼠腫瘤組織中僅存在少量鐵顆粒；原子吸收

13、光譜（AAS）方法證實注射Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠后，荷瘤大鼠腫瘤組織的Fe含量高于注射生理鹽水和MPNA納米凝膠的荷瘤大鼠腫瘤組織的Fe含量，進一步證實了Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠對膠質(zhì)瘤的選擇性。
　　(8)對Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的體外和體內(nèi)毒性進行了評價。噻唑藍（MTT）的結(jié)果顯示在0-100μg/mL濃度范圍內(nèi)，MPNA納米凝膠和Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠對兩種正常細胞（HEK293

14、細胞和 NIH/3T3細胞）的存活率沒有明顯影響。體內(nèi)毒性結(jié)果顯示，注射 MPNA納米凝膠和Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠后，正常大鼠各生化指標(biāo)，包括谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）和各血液功能指標(biāo)，包括白細胞計數(shù)（WBC）、紅細胞計數(shù)（RBC）、血紅蛋白濃度（HGB）和血小板計數(shù)（PLT）均未出現(xiàn)明顯異常。組織病理學(xué)結(jié)果顯示采集的心、肝、脾、肺、腎及腦

15、組織的結(jié)構(gòu)均未發(fā)生明顯變化。
　　綜上所述，Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠具有降低血漿蛋白調(diào)理和巨噬細胞吞噬、延長血漿半衰期，增強向腫瘤組織聚集的能力（被動靶向），同時結(jié)合 Lf對腦腫瘤的受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用（主動靶向），可選擇性提高腦膠質(zhì)瘤細胞對其的攝取能力。Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠的MRI/熒光成像的體內(nèi)外研究表明其將SPION的MRI成像能力和近紅外熒光染料的光學(xué)成像能力有機地結(jié)合起來，具有良好的生物安全性，有望發(fā)