LP(a)通過下調(diào)Akt-eNOS通路損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞.pdf

1、目的:內(nèi)皮祖細(xì)胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）的血管損傷修復(fù)作用及缺血性疾病治療作用已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。本文觀察脂蛋白（a）[Lipoprotein(a)，Lp(a)]對(duì)骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞存活、粘附、遷移、管狀結(jié)構(gòu)生成等生物學(xué)活性的損傷作用，并探討Lp(a)對(duì) EPCs的損傷作用與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）/內(nèi)皮源性一氧化氮合酶（eNOS）信號(hào)通路的關(guān)系，及其損傷作用是否通過LOX-1受體介

2、導(dǎo)。
　　方法:采用密度梯度離心結(jié)合差速貼壁法分離出小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用EGM-2培養(yǎng)基對(duì)EPCs進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化，篩選出類血島細(xì)胞集落，用免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)鑒定出 CD34+/CD133+、CD14+/CD133+EPCs。擴(kuò)增培養(yǎng)后選擇第三代細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)，將密度為107個(gè)/ml的EPCs種植于24孔培養(yǎng)板，將EPCs分為8組（處理24h）：0μg/ml Lp(a)組、25μg/ml Lp(a)組、50μg/ml Lp(a)

3、組、100μg/ml Lp(a)組、100μmol/ml L-Arginine（NO前體）+100μg/ml Lp(a)組、10μg/ml LOX-1mAb（LOX-1單克隆抗體）+100μg/ml Lp(a)組、L-NAME（eNOS抑制劑）組、Triciribine（Akt阻斷劑）組。MTT法檢測(cè)EPCs存活，Hoechst33288染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Transwell測(cè)定細(xì)胞遷移力，基質(zhì)膠測(cè)定成血管能力，RT-PCR檢測(cè)eNOS

4、、LOX-1 mRNA的表達(dá)水平，Westernblot檢測(cè)eNOS、LOX-1、p-Akt的蛋白水平。
　　結(jié)果:Lp(a)呈劑量依賴性抑制EPCs的存活、粘附、遷移、管狀結(jié)構(gòu)形成及NO的生成能力，同時(shí)促進(jìn)EPCs的凋亡，25μg/ml Lp(a)對(duì)EPCs上述生物學(xué)功能影響不顯著（P>0.05，n=3），50μg/ml Lp(a)即表現(xiàn)出顯著抑制EPCs的存活、粘附、遷移、管狀結(jié)構(gòu)形成及NO的生成（P<0.05，n=3），50

5、μg/ml Lp(a)顯著促進(jìn)EPCs凋亡，以100μg/ml的Lp(a)最為顯著（P<0.001，n=3）；此濃度下，EPCs的eNOS mRNA和蛋白表達(dá)水平均均顯著下降，LOX-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高，p-Akt蛋白量降低，100μmol/l L-Arginine和10μg/ml LOX-1mAb可顯著拮抗 Lp(a)對(duì)EPCs的上述作用，同時(shí)eNOS mRNA和蛋白水平均明顯上調(diào)，p-Akt蛋白量升高。N-硝基-L-精氨酸