Graves病患者和動物模型中調(diào)節(jié)性細(xì)胞、Th17細(xì)胞變化以及溴氯哌喹酮對動物模型的干預(yù)研究.pdf

1、Graves病(Graves'disease,GD)是由促甲狀腺激素(Thyroid stimulating hormone,TSH)受體刺激性抗體(Thyroid-stimulating antibody,TSAb)引起的,這種抗體與TSH競爭結(jié)合于TSH受體(TSH receptor,TSHR),模擬TSH的作用促進甲狀腺細(xì)胞分裂(導(dǎo)致甲狀腺腫),并促進甲狀腺激素分泌。除了環(huán)境和遺傳因素外,免疫缺陷也在GD發(fā)病中發(fā)揮重要作用。雖然早

2、前研究已經(jīng)證實GD患者血清中的TSAb是輔助性T細(xì)胞依賴性的,但針對TSHR的自身耐受是如何被打破的,以及自身抗體產(chǎn)生的潛在機制并不清楚。在自身免疫性疾病(包括GD)中,許多研究認(rèn)為打破中樞和外周免疫耐受產(chǎn)生自身抗體是由于免疫調(diào)節(jié)缺陷所造成。調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Regulatory T lymnphocyte,Treg)在防止自身免疫性疾病的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用,其主要通過抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞增殖、促發(fā)其失活而維持機體的穩(wěn)態(tài)。新近研究提示

3、,除致病性B細(xì)胞外,還存在能產(chǎn)生白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)或轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)等細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)性B淋巴細(xì)胞(Regulatory B lymnphocyte,Breg),主要包括CD1dhiCD5+CD19hi表型。Breg通過產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子或分泌抑制性抗體,影響其它免疫細(xì)胞,減緩炎癥癥狀。
　　 目的：本研究旨在觀

4、察GD患者和對照組外周血單個核細(xì)胞Treg、Th17、Breg水平的變化,探討GD的發(fā)病機制。
　　 方法：明確診斷為Graves病的初發(fā)患者20人,同期選取年齡性別匹配的健康對照20人。采集空腹血液標(biāo)本,空腹靜脈促凝血分離血清,測定甲狀腺功能[TSH、FT4(Free thyroxine)]和甲狀腺自身抗體[甲狀腺過氧化物酶抗體(Thyroid peroxidaseantibody,TPOAb)、甲狀腺球蛋白抗體(Thyrog

5、lobulin antibody,VgAb)和TSAb]?？崭轨o脈抗凝血用于分離單個核細(xì)胞,免疫熒光染色,流式細(xì)胞分析檢測外周血單個核細(xì)胞(Peviphary blood monolueclear cell,PBMC)中Treg、Th17、Breg細(xì)胞水平。實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-Time Reverse TranscriptePolymerase Chain Reaction,real-time

6、 RT-PCR)法檢測Treg的轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白P3(forkhead box P3,Foxp3)、Th17的轉(zhuǎn)錄因子視黃酸受體相關(guān)孤兒受體γt(Retinoicacid receptor-related orphan receptorVt,RORγt)、白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)和IL-10的mRNA水平。所有數(shù)據(jù)輸入SPSS16.0。P＜0.05判定為具有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　

7、　 1.Graves病患者CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞百分比與對照組比較明顯降低,IL-17+T細(xì)胞百分比與對照組比較明顯升高,CD1dhiCD5+CD19hiB細(xì)胞百分比與對照組比較明顯降低。
　　 2.GD患者及對照組外周血單個核細(xì)胞Th17細(xì)胞比例與血清TSAb呈正相關(guān),Treg、Breg細(xì)胞比例與TSAb分別呈負(fù)相關(guān)。
　　 3.Graves病患者的Foxp3、IL-10 mRNA表達(dá)量低于對照組,而其

8、RORγt和IL-17mRNA表達(dá)量顯著高于對照組。
　　 結(jié)論：Graves病患者外周血細(xì)胞中CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例及其轉(zhuǎn)錄因子Foxp3mRNA表達(dá)水平均明顯減少,CD1dhiCD5+Bregs細(xì)胞比例及其主要分泌細(xì)胞因子IL-10 mRNA表達(dá)水平均明顯減少,而Th17細(xì)胞比例及其轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA表達(dá)水平均明顯增多。提示Graves病可能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性B細(xì)胞比例降低,而致病性的Th17細(xì)胞比

9、例增多有關(guān)。
　　 背景：理想動物模型的建立是深入研究疾病的發(fā)病機制、探索有效治療措施的途徑之一。但迄今為止還沒有發(fā)現(xiàn)自發(fā)的Graves病(Graves'disease,GD)動物模型。1996年,Shimojo第一次建立了GD的動物模型。此后,研究者相繼建立了不同的GD動物模型。GD由TSHR抗體介導(dǎo)產(chǎn)生,因此一直以來被認(rèn)為是輔助性T細(xì)胞2(Helper T cell2,Th2)型自身免疫病。然而,在人和動物中這一觀點一直被質(zhì)

10、疑,認(rèn)為GD可能并非由經(jīng)典輔助性T細(xì)胞1(Helper T cell1,Th1)/Th2免疫反應(yīng)所致,有其他免疫反應(yīng)[如分泌白細(xì)胞介素17的輔助性T細(xì)胞0nterlettkin-17secreting helper T cells,Th17)]型免疫反應(yīng)存在。研究表明Th17參與人類自身免疫病的發(fā)生發(fā)展,如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)、多發(fā)硬化(Multiple sclerosis,MS)、1型糖尿病(

11、Type1 diabetes mellitus,T1DM)及系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)等。RA的血清和關(guān)節(jié)滑液中IL-17含量很高;MS病變組織的IL-17 mRNA升高18倍;缺失IL17+T細(xì)胞可以使實驗性自身免疫性腦脊髓炎動物模型(Experimental allergic encephalomyelitis,EAE)等自身免疫病的發(fā)病受到抑制:IL-17過表達(dá)可促進SLE發(fā)

12、展,而將IL-17受體敲除則降低SLE嚴(yán)重程度。自發(fā)自身免疫甲狀腺炎動物模型NOD.H2h4小鼠的脾和甲狀腺內(nèi)Th17細(xì)胞增多,IL-17基因敲除小鼠可抵抗高碘誘導(dǎo)的甲狀腺炎。這些結(jié)果提示干預(yù)Th17細(xì)胞免疫途徑可能成為自身免疫病治療的新靶點。一篇發(fā)表于2009年6月的《science》雜志上的文章認(rèn)為溴氯哌喹酮(Halofuginone,HF)可以抑制Th17細(xì)胞的分化,而不改變其他正常免疫細(xì)胞,減輕自身免疫反應(yīng),從而減輕了EAE的發(fā)

13、病。因此HF可能在Th17細(xì)胞致病的自身免疫病中發(fā)揮治療作用。
　　 目的：本研究以TSHRA亞單位-腺病毒(Adenovirus,Ad)載體注射誘導(dǎo)小鼠Graves病動物模型,探討GD模型發(fā)病中Th17細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化,以及溴氯哌喹酮(HF)干預(yù)對Graves病模型發(fā)病及免疫狀態(tài)的影響。
　　 方法：在人胚腎293(Human embryonic kidney293,HEK293)細(xì)胞內(nèi)擴增TSHR A亞單位-

14、腺病毒(Ad-TSHRA)及空載腺病毒(Ad-con)對照,病毒純化,測定病毒滴度。選擇6周齡BALB/c雌鼠,在中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心無特定病原體(Speeefic pathogen Free,SPF)級環(huán)境下飼養(yǎng)。將實驗動物隨機分為4組,每組15只動物。分組如下:
　　 1.Graves病模型組:肌注TSHR A亞單位-腺病毒,每三周免疫一次,共免疫三次,第三次免疫后三周處死。
　　 2.正常對照組:在相同的環(huán)境下

15、,相同時間次數(shù)給予空載腺病毒。
　　 3.Graves病溴氯哌喹酮干預(yù)組:肌注TSHR-A亞單位腺病毒造模的同時,腹腔注射溴氯哌喹酮2μg日/鼠[溴氯哌喹酮溶于二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)中]。
　　 4.Graves病溴氯哌喹酮干預(yù)對照組:肌注TSHR-A亞單位腺病毒建立GD模型的同時,僅肌注DMSO0.2μl/H/鼠。
　　 留取血清,化學(xué)發(fā)光法檢測小鼠游離甲狀腺素(Free

16、thyroxine,FT4):促甲狀腺激素受體刺激性抗體(Thyroid-stimulating hormone antibody,TSAb)測定:使用穩(wěn)定表達(dá)全長血清促甲狀腺激素受體(Thyroid Stimulating Hormone Receptor,TSHR)的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)細(xì)胞,加入稀釋鼠血清,37℃培養(yǎng)。使用環(huán)磷酸腺苷(Cyclic adenosine monopho

17、sphate,cAMP)放射免疫分析(Radioimmunoassay,RLA)試劑盒檢測釋放到培養(yǎng)液中的cAMP濃度。取完整甲狀腺組織,多聚甲醛固定制作石蠟切片蘇木素和伊紅(Hematoxylin and eosin,HE)染色。取脾制成單細(xì)胞,免疫熒光染色、流式細(xì)胞學(xué)檢測Treg、Th17細(xì)胞。實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-Time Reverse Transeripte PolymeraseCha

18、in Reaction,real-time RT-PCR)法檢測叉頭蛋白P3(forkhead box P3,Foxp3)、視黃酸受體相關(guān)孤兒受體γt(Retinoic acid receptor-related orphan receptor,RORγt)和白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)的信使核糖核酸(Messenger ribouncleicacid,mRNA)水平。
　　 結(jié)果：
　　

19、 1、血清FT4和TSAb以Ad-con免疫對照組小鼠-x+3s為正常上限,Ad-con免疫對照組FT4為5.154±0.62 pmol/l,TSAb為(99.4±14.95)％。因此,當(dāng)小鼠血清FT4＞7.01 pmol/l,TSAb大于144.25％為陽性。Ad-TSHRA組中共15只小鼠,其中10只小鼠血清FT4水平高于正常,11只TSAb高于正常。TSAb與T4呈顯著正相關(guān)(r=0.843,p＜0.01)。
　　 甲狀腺

20、組織HE染色,光鏡下顯示:對照組小鼠甲狀腺濾泡大小較一致,細(xì)胞排列比較疏松,上皮細(xì)胞呈低立方狀或扁平狀,濾泡中膠質(zhì)含量比較豐富。Ad-TSHRA造模成功組小鼠甲狀腺濾泡細(xì)胞增生肥大,呈立方狀或高柱狀,濾泡大小不一,濾泡腔中膠質(zhì)含量減少,在增生的甲狀腺濾泡中有乳頭狀折疊凸入濾泡腔,未見淋巴細(xì)胞浸潤。
　　 2、Ad-TSHRA造模+DMSO組中15只小鼠,其中10只小鼠血清FT4水平高于正常,10只TSAb高于正常。Ad-TSHR

21、A造模溴氯哌喹酮干預(yù)組GD發(fā)病率為10/15,與未干預(yù)組發(fā)病率無差異。在Ad-TSHR A+DMSO以及Ad-TSHRA+HF組中,甲狀腺組織病理學(xué)與Ad-TSHRA免疫GD造模組未見明顯差異。
　　 3、Ad-TSHRA免疫GD造模組和Ad-TSHRA+DMSO組小鼠脾臟Treg細(xì)胞比例低于Ad-con免疫組,同時小鼠脾臟Foxp3 mRNA水平亦低于Ad-con組(p＜0.05)。Ad-TSHRA免疫GD造模+HF干預(yù)組中,

22、小鼠脾臟Tregs細(xì)胞比例及小鼠脾臟Foxp3 mRNA表達(dá)均高于GD模型無HF干預(yù)組(p＜0.05)。
　　 4、無論GD模型組、非GD對照組以及HF干預(yù)后的GD模型組小鼠脾臟Th17細(xì)胞比例及小鼠脾臟RORγt、IL-17 mRNA表達(dá)均未見明顯差異(p＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、以TSHRA亞單位.腺病毒免疫6周齡BALB/c雌性小鼠成功建立了Graves病動物模型,成模率66.7％。Grave

23、s病小鼠脾細(xì)胞中Treg細(xì)胞比例降低,Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA表達(dá)減少,Th17細(xì)胞比例和Th17轉(zhuǎn)錄因子RORγt及IL-17 mRNA表達(dá)未見明顯改變,提示Treg異?；騎reg與Th17的表達(dá)失衡可能參與GD模型的發(fā)病。
　　 2、溴氯哌喹酮干預(yù)未減少BALB/c小鼠Graves病發(fā)病率,但增加了小鼠脾臟內(nèi)Treg細(xì)胞比例和Treg轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA表達(dá),但并未改變Th17細(xì)胞比例,Th17轉(zhuǎn)錄