肛門(mén)失禁動(dòng)物模型的構(gòu)建.pdf

1、肛門(mén)失禁是持續(xù)性或反復(fù)發(fā)作的不能感知腸內(nèi)容物性狀或不能控制腸內(nèi)容物的排出，包括液態(tài)、氣態(tài)、固態(tài)的腸內(nèi)容物，是復(fù)雜的、多因素導(dǎo)致的排便功能紊亂，表現(xiàn)為對(duì)氣體或糞便控制能力的損害，導(dǎo)致排便次數(shù)增多，常有腹瀉。這些臨床癥狀經(jīng)常導(dǎo)致患者拒絕參與社交活動(dòng)并嚴(yán)重影響患者的日常生活。雖然相繼提出多種手術(shù)及非手術(shù)治療方式，但各有其局限性與缺點(diǎn)，頑固性肛門(mén)失禁仍然是內(nèi)、外科臨床上十分難處理的問(wèn)題。為此，我們?cè)噲D研制出一種制作肛門(mén)失禁動(dòng)物模型的方法，以期望

2、為制作肛門(mén)失禁動(dòng)物模型提供一種新的思路，為治療肛門(mén)失禁疾病的研究做好基礎(chǔ)性工作。鑒于國(guó)內(nèi)外學(xué)者目前采用的造模方法，研制的新造模方法期望達(dá)到的目標(biāo)主要有：①操作簡(jiǎn)單，無(wú)需昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器及實(shí)驗(yàn)試劑，易于推廣；②微創(chuàng)操作，動(dòng)物死亡率低；③造模效果確切、穩(wěn)定。 根據(jù)既往研究成果，肛門(mén)外括約肌在排便節(jié)制中扮演著重要的角色，其支配神經(jīng)為骶神經(jīng)。Cosovic E等研究發(fā)現(xiàn)局部注射高濃度局麻藥物，可使神經(jīng)在1周后出現(xiàn)變性。局麻藥物神經(jīng)損害程度

3、呈濃度依賴(lài)性，其濃度愈高，損害程度愈重，直至運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)功能永久性喪失。另外，當(dāng)藥物濃度達(dá)到臨界水平時(shí)，局麻藥具有去污劑性質(zhì)，可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，此過(guò)程呈不可逆性改變。神經(jīng)局部注射體積分?jǐn)?shù)0.99乙醇，可導(dǎo)致末梢神經(jīng)阻滯，應(yīng)用于三叉神經(jīng)痛的治療。基于上訴理論，我們初步探索了一種新的肛門(mén)失禁動(dòng)物模型的制作方法，通過(guò)功能性定位肛門(mén)外括約肌支配神經(jīng)，局部注射神經(jīng)毒性藥物，選擇性破壞肛門(mén)外括約肌支配神經(jīng)，使其效應(yīng)肌，即肛門(mén)外括約肌發(fā)生功能障

4、礙，成功制作出肛門(mén)失禁的動(dòng)物模型。 目的: 基于操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、微創(chuàng)操作、造模效果確切穩(wěn)定的理念，研制出一種制作肛門(mén)失禁動(dòng)物模型的新方法，以期望為制作肛門(mén)失禁動(dòng)物模型提供一種新的思路，為治療肛門(mén)失禁疾病的研究做好基礎(chǔ)性工作。 方法: 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組8月齡健康成年雄性新西蘭兔30只，體質(zhì)量2.0-2.5 kg，普通級(jí)飼養(yǎng)。30只新西蘭兔按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)平均分為5組，對(duì)照組A（n=6），局部注射藥物為

5、生理鹽水，術(shù)后8周取局部組織做病理檢查；實(shí)驗(yàn)組B（n=6），局部注射藥物為50g/L羅哌卡因，術(shù)后4周取局部組織做病理檢查；實(shí)驗(yàn)組C（n=6），局部注射藥物為50g/L羅哌卡因，術(shù)后8周取局部組織做病理檢查；實(shí)驗(yàn)組D（n=6），局部注射藥物為體積分?jǐn)?shù)0.99乙醇，術(shù)后4周取局部組織做病理檢查；實(shí)驗(yàn)組E（n=6），局部注射藥物為體積分?jǐn)?shù)0.99乙醇，術(shù)后8周取局部組織做病理檢查。 2.動(dòng)物的麻醉本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的麻醉均采用30g/L戊

6、巴比妥1ml/kg靜脈注射麻醉。 3.測(cè)術(shù)前動(dòng)物麻醉狀態(tài)下肛管內(nèi)靜息壓力（anal canal resting pressure，ARP）固定動(dòng)物，肛門(mén)周?chē)镑静棵撁?，肛管?nèi)置入測(cè)壓水囊，連接三通管、壓力標(biāo)定表、壓力電信號(hào)轉(zhuǎn)換器、十六道生理信號(hào)采集系統(tǒng)PowerLab16/30（ML880）、Dual Bio Amp/Stimulator（ML408），測(cè)動(dòng)物麻醉狀態(tài)下ARP。 4.功能性定位雙側(cè)第4薦神經(jīng)并對(duì)肛門(mén)外括約

7、肌行肌電圖（electromyography，EMG）檢查在離穿刺部位較遠(yuǎn)處安置無(wú)關(guān)電極一枚，與穿刺針及脈沖器連接形成環(huán)路，在肛門(mén)外括約肌上置2枚感應(yīng)電極。將刺激電流開(kāi)至1.5mA，脈沖頻率1 Hz。在兔骶部捫及骶骨下部，按照第4薦神經(jīng)的解剖部位進(jìn)行定位穿刺。當(dāng)與刺激電極相連的穿刺針進(jìn)針達(dá)一定深度，出現(xiàn)與脈沖電流同步的肛門(mén)外括約肌收縮運(yùn)動(dòng)時(shí)，表明穿刺針接近或抵達(dá)第4薦神經(jīng)，此時(shí)將脈沖電流關(guān)至0.5mA，肛門(mén)外括約肌仍在收縮運(yùn)動(dòng)，表明已刺

8、中第4薦神經(jīng)。記錄電極刺入的位置、方向、深度。調(diào)整刺激電流參數(shù)設(shè)置為方波，頻率1Hz，波寬50us，強(qiáng)度5mA。記錄肛門(mén)外括約肌的EMG圖形。 5.神經(jīng)周?chē)⑸渌幬镌诰S持上述電流刺激及監(jiān)測(cè)肛管內(nèi)壓力變化的情況下，于定位好的第4薦神經(jīng)處，回抽無(wú)血液，在兩側(cè)第4薦神經(jīng)處緩慢注射藥物。A組注射生理鹽水0.5ml；B、C組注射50g/L羅哌卡因0.1ml/kg+腎上腺素（1：250000）；D、E組注射體積分?jǐn)?shù)0.99乙醇0.5ml+腎

9、上腺素（1：250000）。均分兩側(cè)第4薦神經(jīng)處注射。 6.測(cè)術(shù)后4周麻醉狀態(tài)下B組、D組動(dòng)物ARP麻醉并固定動(dòng)物，肛門(mén)周?chē)镑静棵撁?，肛管?nèi)置入測(cè)壓水囊，連接三通管、壓力標(biāo)定表、壓力電信號(hào)轉(zhuǎn)換器、十六道生理信號(hào)采集系統(tǒng)PowerLab16/30（ML880）、Dual Bio Amp/Stimulator（ML408），測(cè)動(dòng)物麻醉狀態(tài)下ARP。 7.對(duì)術(shù)后4周麻醉狀態(tài)下B組、D組動(dòng)物行肛門(mén)外括約肌EMG檢查在離穿刺部位

10、較遠(yuǎn)處安置無(wú)關(guān)電極一枚，與穿刺針及脈沖器連接形成環(huán)路，在肛門(mén)外括約肌上置2枚感應(yīng)電極。將刺激電流開(kāi)至1.5 mA，脈沖頻率1 Hz。按記錄的電極刺入的位置、方向、深度刺入，觀察肛門(mén)外括約肌的運(yùn)動(dòng)情況，必要時(shí)將電流刺激強(qiáng)度增加至5mA。記錄肛門(mén)外括約肌的EMG圖形。 8.測(cè)術(shù)后8周麻醉狀態(tài)下A組、C組、E組動(dòng)物ARP麻醉并固定動(dòng)物，肛門(mén)周?chē)镑静棵撁毓軆?nèi)置入測(cè)壓水囊，連接三通管、壓力標(biāo)定表、壓力電信號(hào)轉(zhuǎn)換器、十六道生理信號(hào)采集

11、系統(tǒng)PowerLab16/30（ML880）、Dual Bio Amp/Stimulator（ML408），測(cè)動(dòng)物麻醉狀態(tài)下ARP。 9.對(duì)術(shù)后8周麻醉狀態(tài)下A組、C組、E組動(dòng)物行肛門(mén)外括約肌EMG檢查在離穿刺部位較遠(yuǎn)處安置無(wú)關(guān)電極一枚，與穿刺針及脈沖器連接形成環(huán)路，在肛門(mén)外括約肌上置2枚感應(yīng)電極。將刺激電流開(kāi)至1.5 mA，脈沖頻率1 Hz。按記錄的電極刺入的位置、方向、深度刺入，觀察肛門(mén)外括約肌的運(yùn)動(dòng)情況，必要時(shí)將電流刺激強(qiáng)

12、度增加至5mA。記錄肛門(mén)外括約肌的EMG圖形。 10.標(biāo)本的獲取及處理術(shù)后4周處死B組、D組動(dòng)物，術(shù)后8周處死A組、C組、E組動(dòng)物，解剖分離肛門(mén)外括約肌、注射藥物部位第4薦神經(jīng)根及神經(jīng)周?chē)M織，仔細(xì)觀察大體形態(tài)學(xué)改變。取肛門(mén)外括約肌、神經(jīng)周?chē)M織置于4%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度10um，HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察注射藥物部位第4薦神經(jīng)周?chē)M織、肛門(mén)外括約肌組織形態(tài)學(xué)變化。取注射藥物部位第4薦神經(jīng)，大小約1.0mm

13、×1.0mm×1.0mm，立即投放至4℃預(yù)冷的30g/L戊二醛溶液固定，再放置4℃保存，逐級(jí)乙醇脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，切片厚度60nm，鉛鈾染色，于透射電鏡下觀察第4薦神經(jīng)根細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 11.數(shù)據(jù)讀取和分析肛管內(nèi)測(cè)壓及肛門(mén)外括約肌EMG檢查結(jié)果通過(guò)Lab Chart Reader V6.1讀取并分析 12.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組手術(shù)前、手術(shù)后ARP及手術(shù)前后ARP差值，以x±S形式表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)

14、行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組的術(shù)前、術(shù)后、手術(shù)前后ARP差值的比較采用方差分析，組間的多重比較采用LSD檢驗(yàn)，α=0.05作為差異顯著性水平。各組動(dòng)物雙側(cè)肛門(mén)外括約肌支配神經(jīng)術(shù)后神經(jīng)EMG檢查EMG改變是否明顯，以計(jì)數(shù)資料形式表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組動(dòng)物EMG改變明顯率的比較采用雙向無(wú)序R×c表資料的Fisher確切概率法檢驗(yàn)。 結(jié)論: 1.肛門(mén)失禁動(dòng)物模型構(gòu)建方法有效局部注射神經(jīng)毒性藥物，選擇性

15、破壞肛門(mén)外括約肌支配神經(jīng)，能夠成功制作出肛門(mén)失禁動(dòng)物模型； 2.肛門(mén)失禁動(dòng)物模型穩(wěn)定性好在術(shù)后8W時(shí)，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物仍符合肛門(mén)失禁診斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合病理檢查結(jié)果，肛門(mén)失禁動(dòng)物模型穩(wěn)定； 3.操作簡(jiǎn)單，易于推廣本課題選用的實(shí)驗(yàn)試劑及儀器設(shè)備均為實(shí)驗(yàn)室常用試劑及儀器設(shè)備，易于推廣。采用神經(jīng)定位方式，準(zhǔn)確、完整地破壞支配肛門(mén)外擴(kuò)約肌的神經(jīng)主干，迅速使肛門(mén)外擴(kuò)約肌癱瘓，達(dá)到構(gòu)建肛門(mén)失禁動(dòng)物模型的目的，操作過(guò)程簡(jiǎn)單易行； 4.微創(chuàng)