腎上腺素刺激的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植干預(yù)實(shí)驗(yàn)性肺損傷的研究.pdf

1、急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征是引起重癥患者急性呼吸衰竭的最主要的原因，死亡率高達(dá)40％。臨床前研究發(fā)現(xiàn)，骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)移植可以減輕多種實(shí)驗(yàn)性肺損傷，包括LPS、博萊霉素、機(jī)械通氣和缺血再灌注誘導(dǎo)的肺損傷。早期的研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs可以通過(guò)分化為肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)促進(jìn)肺損傷修復(fù)。近年來(lái)，一些實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)BMSCs可以

2、通過(guò)一些旁分泌的因子調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)來(lái)修復(fù)肺損傷。小鼠膿毒癥模型中，BMSCs通過(guò)釋放前列腺素E2促進(jìn)巨噬細(xì)胞抗炎因子IL-10的產(chǎn)生，從而降低死亡率和減輕肺損傷。BMSCs通過(guò)旁分泌IL-1受體拮抗劑(IL-1 receptor antagonist，IL-1ra)抑制巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥性損傷。
　　一些實(shí)驗(yàn)性肺損傷中，腎上腺素能受體激動(dòng)劑特別是β腎上腺素能受體激動(dòng)劑，可以通過(guò)促進(jìn)肺水吸收和抑

3、制炎癥反應(yīng)來(lái)促進(jìn)肺損傷修復(fù)。腎上腺素能受體激動(dòng)劑還可以促進(jìn)胚胎干細(xì)胞和BMSCs的DNA合成，保護(hù)間充質(zhì)干細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。
　　本研究首先評(píng)估BMSCs移植對(duì)大鼠鹽酸吸入性肺損傷的作用及其機(jī)制;研究不同的腎上腺素能受體激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)BMSCs生物學(xué)行為的影響:在體外模型中研究腎上腺素對(duì)BMSCs遷移的影響，并且在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中評(píng)估腎上腺素是否可以幫助BMSCs調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和修復(fù)實(shí)驗(yàn)性肺損傷，同時(shí)初步探討其機(jī)制。
　　

4、第一部分、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植減輕大鼠鹽酸吸入性肺損傷的作用及其機(jī)制
　　目的:研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植對(duì)大鼠鹽酸吸入性肺損傷的作用并探討機(jī)制。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心進(jìn)行。改良貼壁法分離培養(yǎng)Sprague-Dawley(SD)大鼠BMSCs，進(jìn)行形態(tài)學(xué)、表面標(biāo)記物和誘導(dǎo)分化鑒定。24只SD大鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組，損傷組和移植組。損傷組和移植組氣道內(nèi)滴注鹽酸(1.2ml/kg pH

5、=1.5)，對(duì)照組則滴入等量磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，用動(dòng)脈血?dú)狻⒎谓M織濕干比和病理改變?cè)u(píng)價(jià)模型是否成功建立。移植組于頸外靜脈注射5×106個(gè)BMSCs，其它2組注入0.5ml的PBS。移植6h后行動(dòng)脈血?dú)夥治?，酶?lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清和支氣管肺泡灌洗液(BALF)的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)濃度，觀察肺組織病理改變和測(cè)定肺組織濕干比。體外實(shí)驗(yàn)中，BMSCs與損傷肺細(xì)胞

6、或正常肺細(xì)胞于Transwell體系共培養(yǎng)36h，觀察損傷肺影響B(tài)MSCs遷移情況;另取BMSCs與損傷肺細(xì)胞混合培養(yǎng)或于Transwell中培養(yǎng)，正常肺細(xì)胞或損傷肺細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)作對(duì)照，6h后檢測(cè)上清TNF-α、IL-6和IL-10濃度。用方差分析比較多組間的差異，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組的差別。
　　結(jié)果:分離培養(yǎng)的BMSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。BMSCs移植改善了肺損傷大鼠的低氧血癥(P＜0.01)和肺組織損傷，降低了肺組織

7、濕干比(P＜0.01)，降低了血清和BALF的TNF-α水平(P＜0.05;P＜0.01)，升高了血清和BALF的IL-10濃度（P＜0.01），對(duì)IL-6水平無(wú)明顯影響（P＞0.05）。體外實(shí)驗(yàn)中，BMSCs向損傷肺遷移明顯多于向正常肺遷移(P＜0.01)，BMSCs與肺細(xì)胞接觸或不接觸的共培養(yǎng)均降低了上清液TNF-α濃度（P＜0.01），升高了IL-10濃度（P＜0.01），對(duì)IL-6濃度無(wú)影響(P＞0.05)。
　　結(jié)論:B

8、MSCs移植可以減輕大鼠鹽酸吸入性肺損傷，可能的機(jī)制為干細(xì)胞通過(guò)旁分泌途徑下調(diào)炎癥反應(yīng)。
　　第二部分、腎上腺素能受體參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的研究
　　目的:研究不同的腎上腺素能受體激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)BMSCs生物學(xué)行為的影響。
　　方法:用不同濃度的腎上腺素(0-100μM)，α受體激動(dòng)劑去甲腎上腺素，β受體激動(dòng)劑異丙腎上腺素，或聯(lián)用腎上腺素和受體拮抗劑作用于BMSCs，在Cell-IQ實(shí)時(shí)細(xì)胞監(jiān)測(cè)平臺(tái)觀察細(xì)胞增殖、

9、死亡和運(yùn)動(dòng)。每5min拍攝一次，連續(xù)觀察72 h后計(jì)算細(xì)胞總數(shù)增加百分比、分裂細(xì)胞數(shù)、死亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞移動(dòng)距離。
　　結(jié)果:10μM濃度的腎上腺素同對(duì)照相比，可以顯著加速細(xì)胞增殖，這個(gè)作用6h時(shí)開始出現(xiàn)，18-24 h時(shí)達(dá)到高峰;而促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用逐漸出現(xiàn)，36h時(shí)到達(dá)高峰。1μM濃度的腎上腺素對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響，而100μM的腎上腺素可以抑制增殖。各濃度的腎上腺素對(duì)死亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)距離無(wú)影響。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇10μM濃度

10、進(jìn)行研究。10μM濃度的去甲腎上腺素和異丙腎上腺素促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用類似，而均弱于同樣濃度的腎上腺素。去甲腎上腺素和異丙腎上腺素對(duì)細(xì)胞死亡和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)均無(wú)明顯影響。10μM濃度的酚妥拉明和普萘洛爾和腎上腺素分別聯(lián)用時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖有類似的抑制作用。酚妥拉明和普萘洛爾和腎上腺素分別聯(lián)用時(shí)，對(duì)細(xì)胞死亡和運(yùn)動(dòng)無(wú)顯著影響。
　　結(jié)論:10μM濃度的腎上腺素具有促進(jìn)BMSCs增殖的作用，并且是腎上腺素能受體相關(guān)的，α或β受體激動(dòng)后均有促增殖效應(yīng)

11、。
　　第三部分、腎上腺素刺激的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)LPS誘導(dǎo)急性肺損傷修復(fù)的作用及機(jī)制探討
　　目的:評(píng)估腎上腺素刺激的BMSCs是否可以減輕體內(nèi)和體外模型中的LPS肺損傷并探討其機(jī)制。
　　方法:將正常大鼠的肺細(xì)胞或LPS損傷大鼠的肺細(xì)胞與BMSCs（有或無(wú)腎上腺素刺激）共培養(yǎng)于Transwell中(膜孔徑8 um)，36h后計(jì)數(shù)遷移的BMSCs數(shù)量。另將正常大鼠或LPS損傷大鼠的肺組織塊與BMSCs（有或無(wú)腎上腺

12、素刺激）共培養(yǎng)于6孔板中，24h后觀察并計(jì)數(shù)向肺組織遷移和粘附的BMSCs數(shù)量。LPS刺激的巨噬細(xì)胞和BMSCs共培養(yǎng)于Transwell中(膜孔徑0.4um)，6h后取上清液ELISA檢測(cè)TNF-α, IL-1β，IL-6，IL-10，IL-13，血管生成素-1，KGF和IL-1ra濃度。同時(shí)取BMSCs用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)血管生成素-1，KGF，IL-1ra，IL-10和IL-13基因表達(dá)。Western blot測(cè)BMSCs的IL-

13、10，IL-13，KGF和IL-1ra蛋白表達(dá)。初步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用于驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)，大鼠靜脈注射BMSCs，腎上腺素刺激的BMSCs，BMSCs（有或無(wú)腎上腺素刺激）的條件培養(yǎng)液，腎上腺素或PBS進(jìn)行預(yù)處理，24 h后氣管內(nèi)注射LPS造模。造模后24h觀察肺組織病理改變。
　　結(jié)果:10μM濃度的腎上腺素促進(jìn)了BMSCs向損傷肺細(xì)胞的遷移，還促進(jìn)了向損傷肺組織的遷移和粘附。體外肺損傷模型中，腎上腺素刺激的BMSCs降低了TNF-

14、α和IL-1β濃度，升高了IL-10濃度，促進(jìn)了炎癥反應(yīng)的下調(diào)，而這個(gè)作用可能與腎上腺素促進(jìn)一些旁分泌因子包括血管生成素-1，KGF，IL-1ra，IL-10和IL-13的表達(dá)和分泌有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，腎上腺素刺激的BMSCs促進(jìn)了肺損傷的修復(fù)。結(jié)論:腎上腺素通過(guò)腎上腺素能受體激活BMSCs，促進(jìn)BMSCs增殖和向損傷肺的遷移，與損傷肺相互作用，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)了肺損傷的修復(fù)。
　　結(jié)論：
　　1.BMSCs移植可以減輕

15、大鼠鹽酸吸入性肺損傷，可能的機(jī)制為干細(xì)胞通過(guò)旁分泌途徑下調(diào)炎癥反應(yīng)。
　　2.10μM濃度的腎上腺素具有促進(jìn)BMSCs增殖的作用，并且是腎上腺素能受體相關(guān)的，α或β受體激動(dòng)后均有促增殖效應(yīng)。
　　3.腎上腺素激活BMSCs，促進(jìn)BMSCs增殖和向損傷肺的遷移，與損傷肺相互作用，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)了肺損傷的修復(fù)。
　　創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.我們的研究首次發(fā)現(xiàn)，在體外共培養(yǎng)模型中，損傷肺組織可以促進(jìn)BMSCs的遷移和