Niban在腎間質纖維化中的研究.pdf

1、第一章腎間質纖維化差異蛋白的篩選
　　研究背景:腎間質纖維化(Renal Interstitial Fibrosis，RIF)以腎小管擴張和間質纖維化為特征。研究認為，RIF的程度預示著腎功能受損的程度，與病人腎臟疾病的預后密切相關。RIF是各種慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease，CKD)向終末期進展過程中的一種共同病理表現(xiàn)。研究RIF的作用機制，尋找RIF的生物標志物，探索防治RIF的有效措施，對于延緩慢性

2、腎臟疾病的進程意義重大，是目前全球腎病研究的熱點和難點。腎間質纖維化的發(fā)生、發(fā)展受多方面因素的影響，腎小管上皮細胞凋亡、炎癥反應、氧化應激、成纖維細胞增殖與活化、腎小管上皮細胞轉分化、細胞因子及血管活性物質的產生、細胞外基質合成和降解失衡等均參與其過程。鑒于腎間質纖維化機制的復雜性，我們認為目前已有的研究結果并不能完全解釋腎間質纖維化的發(fā)病過程，應該還存在尚未引起重視的、可以影響腎間質纖維化過程的新蛋白、新機制。本實驗擬通過聯(lián)合蛋白質組

3、學及基因芯片研究的方法，對腎間質纖維化經典模型——單側輸尿管梗阻(UnilateralUreteral Obstruction，UUO)大鼠腎組織中的差異蛋白進行篩選，尋找腎間質纖維化過程的生物標志物。
　　目的:在3天、7天、14天、21天UUO大鼠腎組織中，以蛋白質組學聯(lián)合基因芯片的分析方法，篩選腎間質纖維化過程中有意義的差異蛋白。
　　方法:建立腎間質纖維化UUO大鼠模型。SD大鼠（25只）隨機分為假手術組、3天、7天

4、、14天、21天UUO模型組（每組5只）;于UUO術后3、7、14、21天留取各組大鼠梗阻側腎臟標本，行HE染色觀察大鼠腎間質纖維化程度。MASSON染色、Ⅲ型膠原免疫組化橫斷面觀察14天UUO大鼠腎間質纖維化成模情況。同位素標記相對和絕對定量(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation,iTRAQ)技術篩選3天、7天、14天、21天UUO大鼠腎組織差異蛋白表達譜，并與基因芯

5、片的結果進行配對分析，尋找腎間質纖維化過程中有意義的差異蛋白。
　　結果:(1) HE染色結果提示UUO模型成功，3天、7天、14天、21天UUO大鼠腎組織按時間呈現(xiàn)不同程度的腎小管擴張及間質纖維化。14天UUO組大鼠腎臟的腎間質損傷指數(shù)、細胞外基質以及Ⅲ型膠原表達量均比假手術組明顯升高(p＜0.05)。
　　(2)鑒于我們主要著眼于尋找腎間質纖維化早中期的生物標志物，我們以iTRAQ聯(lián)合基因芯片篩選3天、7天、14天UUO

6、大鼠腎組織中有意義的差異蛋白。與假手術組比較，UUO術后3天、7天、14天四個時間點，差異蛋白持續(xù)上/下調（蛋白表達改變＞1.2 or＜0.8），且滿足相對應的基因表達＞2.0 or＜0.5的蛋白，共15個;其中持續(xù)上調的差異蛋白共9個;持續(xù)下調的差異蛋白共6個（包括Niban）。
　　(3) Niban與腎間質纖維化的關系尚不明確，故確定Niban為本研究組后續(xù)研究的目標蛋白，重點研究Niban在腎間質纖維化中的表達及可能的作用

7、機制。
　　第二章 Niban在腎間質纖維化中的表達
　　研究背景:Niban是2000年由Majima首次發(fā)現(xiàn)的蛋白，主要在細胞質中表達。Niban最早在Eker大鼠（一種遺傳性腎臟腫瘤的大鼠模型）中發(fā)現(xiàn)。在人和動物的其他腎臟腫瘤、患者頭頸部鱗癌、頭頸部發(fā)育不良組織、酗酒/嗜煙及甲狀腺損傷患者粘膜上皮組織中，Niban均表達升高。Niban可能作為一種早期腫瘤標志物，對細胞起促進增殖、抑制凋亡的作用?；诒狙芯拷M前期實驗中

8、Niban在蛋白質組學及基因芯片中的結果，本章節(jié)擬對Niban與腎間質纖維化的關系進行驗證。
　　目的:通過病人、動物及細胞實驗，進一步以體內外實驗對腎間質纖維化中Niban蛋白及mRNA表達進行驗證。
　　方法:免疫組織化學法對梗阻性腎病患者腎組織中Niban蛋白表達進行定位及半定量檢測;免疫組織化學法、Westem Blot法對UUO大鼠腎組織中Niban蛋白表達進行定位及半定量檢測;Real time-PCR檢測Nib

9、an mRNA的表達。以TGF-β1(10ng/ml)孵育HK-2細胞48小時，誘導HK-2細胞凋亡，構建體外腎間質纖維化模型。Western Blot法檢測TGF-β1誘導的HK-2細胞中Niban、FN的表達，進一步在體外實驗中驗證腎間質纖維化時Niban的表達情況，F(xiàn)N評估HK-2細胞纖維化狀態(tài)。
　　結果:1）梗阻性腎病患者腎組織中Niban表達較正常對照組明顯減少;
　　2）UUO大鼠腎組織中Niban蛋白表達較假

10、手術組明顯減少;而UUO大鼠腎組織中Niban mRNA表達較假手術組升高;
　　3）TGF-β1孵育HK-2細胞48小時后，F(xiàn)N表達升高，Niban表達減少。
　　結論:1）Niban在UUO大鼠及梗阻性腎病患者腎組織中表達減少;
　　2）Niban在TGF-β1誘導的體外腎間質纖維化模型（HK-2）中表達減少。
　　第三章 Niban在腎間質纖維化中的作用機制探討
　　研究背景:腎間質纖維化以腎小管擴張

11、和間質纖維化為特征，與慢性腎臟病的進展密切相關。腎間質纖維化的程度預示著腎功能受損的程度，與患者腎臟疾病的預后關系密切。腎間質纖維化的作用機制復雜，涉及到多個步驟及環(huán)節(jié)，腎小管上皮細胞凋亡、轉分化、巨噬細胞浸潤、炎癥、氧化應激、多種細胞因子及血管活性物質產生等均參與腎間質纖維化的過程。其中，凋亡在誘發(fā)腎小管上皮細胞萎縮及腎間質纖維化形成中起重要作用。
　　凋亡(Apoptosis)也稱為“程序性細胞死亡”或“細胞自殺”，是一種遺傳

12、控制的生理性死亡。在正常情況下，凋亡起消除老化細胞或未參與免疫反應的淋巴細胞的作用;而發(fā)生病理性改變時，凋亡則可以對腫瘤生成在內的多種病理情況起作用。時至今日，已經在多種腎病模型和臨床患者腎臟病理檢測中，觀察到了腎小管上皮細胞的凋亡現(xiàn)象。
　　Niban的相關研究顯示，它是一種功能蛋白。Niban可以通過影響真核轉錄起始因子——eIF2α及S6K1/4E-BP1磷酸化，在轉錄水平調節(jié)細胞死亡信號;Niban還通過競爭性拮抗MDM2

13、（AKT通路下游的一個作用底物），導致P53降解增多，發(fā)揮抑制凋亡的作用。Niban在腎纖維化領域的作用研究，尚不明確?；贜iban對腫瘤細胞凋亡的調控作用，以及上一章我們對Niban在腎間質纖維化中表達的驗證，本章節(jié)擬對Niban在腎小管上皮細胞凋亡中的作用進行觀察，以探討Niban在腎間質纖維化中的可能作用機制。
　　目的:觀察UUO大鼠腎組織及TGF-β1(10ng/ml)孵育48小時后腎小管上皮細胞(HK-2)凋亡情況;

14、觀察Niban表達量改變（沉默或過表達）時，對腎小管上皮細胞凋亡的影響。
　　方法:TUNEL法檢測UUO大鼠腎小管上皮細胞凋亡情況;TUNEL法及流式細胞儀檢測TGF-β1孵育48小時后HK-2細胞凋亡情況;TUNEL法及流式細胞儀檢測siRNA沉默Niban后HK-2細胞凋亡情況;Western Blot法對siRNA沉默Niban的效果進行檢測;流式細胞儀檢測Niban質粒轉染后HK-2細胞凋亡情況。
　　結果:1）與

15、假手術組相比，UUO組大鼠腎小管上皮細胞凋亡明顯增加;
　　2）與對照組相比，TGF-β1孵育后HK-2細胞凋亡明顯增多;
　　3) siRNA沉默Niban后，HK-2細胞凋亡增加，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義;
　　4）Niban質粒轉入HK-2細胞，TGF-β1干預后細胞凋亡未見減少。
　　結論:1）腎間質纖維化時，腎小管上皮細胞凋亡增加，Niban表達減少，兩者趨勢相反;
　　2）沉默Niban的