Toll樣受體在誘導(dǎo)小鼠小腸移植免疫耐受中的作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分小鼠異位小腸移植模型的建立。
　　 目的：建立穩(wěn)定的小鼠異位小腸移植模型。
　　 方法：采用小腸供體的門(mén)靜脈(Portal vein，PV)與受體下腔靜脈(Inferior vena cava，IVC)端側(cè)吻合，供體帶主動(dòng)脈片的腸系膜上動(dòng)脈(Superior mesenteric artery，SMA)與受體腹主動(dòng)脈端側(cè)吻合，供體近端腸管結(jié)扎，遠(yuǎn)端與受體空腸端側(cè)吻合的方式建立異位小腸移植模型。選用C57BL/6小

2、鼠做供體和BALB/c小鼠作受體進(jìn)行同種異基因型異位節(jié)段性小腸移植(Small bowel transplantation，SBT)。術(shù)后禁食3天，不禁飲，每天分兩次經(jīng)皮下分別給予5％葡萄糖生理鹽水2ml，術(shù)后不使用抗生素和免疫抑制劑。小鼠存活超過(guò)5天認(rèn)為手術(shù)成功。
　　 結(jié)果：建模初期共完成50例，僅有9例完成了手術(shù)全過(guò)程，其余41例均在手術(shù)過(guò)程中死亡，死亡原因?yàn)閯?dòng)脈吻合口血栓形成20例，大出血致出血性休克8例，門(mén)靜脈吻合口血

3、栓形成5例，吻合后血管狹窄3例，麻醉意外3例，術(shù)后腹腔內(nèi)感染1只，原因不明1例。建模成熟穩(wěn)定期共完成60例定型手術(shù)，供體手術(shù)時(shí)間37.18±5.40min，熱缺血時(shí)間約0.5min，供體腸段腸系膜上動(dòng)脈組織片修整時(shí)間為3.58±0.52min，供體冷保存時(shí)間為29.76±3.22min，受體手術(shù)時(shí)間80.28±2.25min，其中腹主動(dòng)脈及下腔靜脈阻斷時(shí)間為38.15±2.71min，靜脈吻合時(shí)間11.03±0.67min，動(dòng)脈吻合時(shí)間

4、16.32±1.60min，成活小鼠受體手術(shù)平均出血量約0.2ml。術(shù)后24h存活率為80％(48/60)，術(shù)后5天生存率為70％(42/60)。手術(shù)失敗的18只小鼠主要死亡原因?yàn)閯?dòng)脈吻合口血栓形成8例，動(dòng)脈吻合口部位狹窄4例，吻合口出血導(dǎo)致出血性休克4只，術(shù)后腹腔內(nèi)感染1只，原因不明1例。
　　 結(jié)論：
　　 1、采用改良方法建立的小鼠異位小腸移植模型穩(wěn)定可靠，可為后繼實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)；
　　 2、小鼠小腸移植

5、手術(shù)難度大，良好的供體腸段的獲取、高質(zhì)量的血管吻合及供、受體補(bǔ)液是提高小鼠小腸移植手術(shù)成功率的關(guān)鍵。
　　 第二部分小鼠小腸移植排斥反應(yīng)的觀(guān)察。
　　 目的：探討各種免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子在小鼠小腸移植排斥反應(yīng)中的作用及可能機(jī)制，尋找反映排斥反應(yīng)的指標(biāo)。
　　 方法：供體為C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠，受體為BALB/c小鼠，均為雄性，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組，n=6：A組為BALB/c→BALB/c組，術(shù)后(

6、Post operation day，POD)11天處死；B組為C57BL/6→BALB/c組，POD3處死；C組為C57BL/6→BALB/c組，POD7處死；D組為C57BL/6→BALB/c組，POD11處死。采用前述方式建立小鼠異位小腸移植模型，于術(shù)后相應(yīng)天數(shù)獲取標(biāo)本。稱(chēng)取受體脾臟重量并分離脾臟細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)血清IL-10、IFN-γ和IL-17濃度水平，HE(Hematoxylin-Eosin)染色觀(guān)察移植小腸病理變化

7、，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)受體小鼠脾臟及移植小腸內(nèi)浸潤(rùn)細(xì)胞中各種細(xì)胞亞型。
　　 結(jié)果：移植小腸組織病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，A組無(wú)排斥反應(yīng)發(fā)生，B組為輕度排斥反應(yīng)，C組為中度排斥反應(yīng)，D組為重度排斥反應(yīng)；血清中IL-10、IL-17水平在各組間均具有顯著差異(P<0.05)，IL-10在A(yíng)、B、C、D組中依次降低，而IL-17則相反，在A(yíng)、B、C、D組中依次增高；血清中IFN-γ水平，A組與B組無(wú)顯著差異(P>0.05)，B、C、D組間均有顯著

8、差異(P<0.05)，在B、C、D組中依次增高；脾臟重量及其細(xì)胞數(shù)，各組間均具有顯著差異(P<0.05)，在A(yíng)、B、C、D組中依次增高；脾臟中T細(xì)胞與B細(xì)胞比例，A組與B組均無(wú)顯著差異(P>0.05)，B、C、D組間均具有顯著差異(P<0.05)，在B、C、D組中均依次降低；脾臟中中性粒細(xì)胞比例在各組間均有顯著差異(P<0.05)，在A(yíng)、B、C、D組中依次增高；脾臟T細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞比例，A組與B組、C組與D組均無(wú)顯著差異(P>0.

9、05)，C組較B組顯著降低(P<0.05)；脾臟T細(xì)胞中CD8+T細(xì)胞比例，A組與B組、C組與D組均無(wú)顯著差異(P>0.05)，C組較B組顯著增高(P<0.05)；脾臟T細(xì)胞中CD4-CD8-T細(xì)胞比例，A組與B組無(wú)顯著差異(P>0.05)，B、C、D組間均具有顯著差異(P<0.05)，在B、C、D組中依次增高；脾臟CD4+T細(xì)胞中Th1細(xì)胞比例和CD8+T細(xì)胞中Tc1細(xì)胞比例，A組與B組均無(wú)顯著差異(P>0.05)，B、C、D組間均具

10、有顯著差異(P<0.05)，在B、C、D組中均依次增高；脾臟CD4+T細(xì)胞中Th2細(xì)胞與Th17細(xì)胞比例，各組間均具有顯著差異(P<0.05)，Th2細(xì)胞在A(yíng)、B、C、D組中依次降低；而Th17細(xì)胞則相反，在A(yíng)、B、C、D組中依次增高；移植小腸浸潤(rùn)細(xì)胞中T細(xì)胞比例，A、B、C組間均具有顯著差異(P<0.05)，在A(yíng)、B、C組中依次降低，C組與D組無(wú)顯著差異(P>0.05)；移植小腸浸潤(rùn)細(xì)胞中B細(xì)胞及中性粒細(xì)胞比例在各組間均具有顯著差異(

11、P<0.05)，B細(xì)胞在A(yíng)、B、C、D組中依次降低，中性粒細(xì)胞則在A(yíng)、B、C、D組中依次增高；移植小腸浸潤(rùn)T細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞比例在各組間均具有顯著差異(P<0.05)，CD4+T細(xì)胞在A(yíng)、B、C、D組中依次降低，CD8+T細(xì)胞則在A(yíng)、B、C、D組中依次增高；移植小腸浸潤(rùn)T細(xì)胞中CD4-CD8-T細(xì)胞比例，在A(yíng)、B、C、D組間均無(wú)顯著差異(P>0.05)；移植小腸浸潤(rùn)C(jī)D4+T細(xì)胞中Th1、Th17細(xì)胞比例及浸潤(rùn)C(jī)D8

12、+T細(xì)胞中Tc1細(xì)胞比例，各組間均具有顯著差異(P<0.05)，在A(yíng)、B、C、D組中均依次增高；移植小腸浸潤(rùn)C(jī)D4+T細(xì)胞中Th2細(xì)胞比例，A組與B組無(wú)顯著差異(P>0.05)，B、C、D組間均具有顯著差異(P<0.05)，在B、C、D組中依次降低。
　　 結(jié)論：
　　 1、小腸移植術(shù)后排斥反應(yīng)是以T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為中心的多種免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的復(fù)雜過(guò)程；
　　 2、Th1、Th17及Tc1細(xì)胞參與了

13、移植后排斥反應(yīng)，其細(xì)胞數(shù)量及相應(yīng)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-17濃度可作為反映排斥反應(yīng)的指標(biāo)；
　　 3、Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-10具有免疫調(diào)節(jié)作用，可誘導(dǎo)免疫耐受。
　　 第三部分 Toll樣受體在小鼠小腸移植排斥反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫耐受中的作用及其機(jī)制的研究。
　　 目的：研究Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)在小腸移植排斥反應(yīng)中的作用及可能機(jī)制，探討在小腸移植中通過(guò)阻斷TLRs

14、信號(hào)傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)特異性免疫耐受的可能性及其可能機(jī)制。
　　 方法：供體為C57BL/6小鼠，受體為野生型或MyD88-/-BALB/c小鼠，均為雄性，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組：A組為C57BL/6→BALB/c組，POD7處死；B組為C57BL/6→MyD88-/-BALB/c組，POD7處死；C組為C57BL/6→BALB/c組，POD11處死；D組為C57BL/6→MyD88-/-BALB/c組，POD11處死。采用前述方式建

15、立小鼠異位小腸移植模型，于術(shù)后相應(yīng)天數(shù)獲取標(biāo)本。各組分別重復(fù)7次實(shí)驗(yàn)后，其中1次取受體脾臟行免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC)染色，6次行其余實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取均值(n=6)。稱(chēng)取受體脾臟重量并分離脾臟細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)血清IL-10、IFN-γ和IL-17濃度水平，HE染色觀(guān)察移植小腸病理變化，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)受體小鼠脾臟及移植小腸內(nèi)浸潤(rùn)細(xì)胞中各種細(xì)胞亞型，同時(shí)獲取脾臟細(xì)胞行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(Mixed

16、 lymphocytes reaction，MLR)。
　　 結(jié)果：移植小腸組織病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，A組發(fā)生中度排斥反應(yīng)，B組為輕度排斥反應(yīng)，C組為重度排斥反應(yīng)，D組為輕-中度排斥反應(yīng)；血清中IL-10水平，B組較A組、D組較C組均顯著增高(P<0.05)；血清中IFN-γ與IL-17水平，B組較A組、D組較C組均顯著降低(P<0.05)；受體脾臟重量及其細(xì)胞數(shù)，B組較A組、D組較C組均顯著降低(P<0.05)；脾臟T細(xì)胞和移植小腸

17、浸潤(rùn)T細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell，Treg)比例，B組較A組、D組較C組均顯著增高(P<0.05)；移植小腸浸潤(rùn)T細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞比例，B組較A組、D組較C組均顯著增高(P<0.05)；移植小腸浸潤(rùn)T細(xì)胞中CD8+T細(xì)胞比例，B組較A組、D組較C組均顯著降低(P<0.05)；移植小腸浸潤(rùn)T細(xì)胞中CD4-CD8-T細(xì)胞比例，B組較A組、D組較C組均無(wú)顯著差異(P>0.05)；脾臟和移植小腸浸潤(rùn)C(jī)D4+T細(xì)胞

18、中Th1、Th17細(xì)胞比例及CD8+T細(xì)胞中Tc1細(xì)胞比例，B組較A組、D組較C組均顯著降低(P<0.05)；脾臟和移植小腸浸潤(rùn)C(jī)D4+T細(xì)胞中Th2細(xì)胞比例，B組較A組、D組較C組均顯著增高(P<0.05)；脾臟行Foxp3IHC染色計(jì)數(shù)Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，B組較A組、D組較C組均顯著增高(P<0.05)；MLR示刺激指數(shù)，B組較A組、D組較C組均顯著降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、TLRs在小腸移