血小板蛋白酶激活受體-1激活在誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞SW620細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用和機制.pdf

1、結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，而區(qū)域淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移常導(dǎo)致治療失敗。腫瘤細胞發(fā)生上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymaltransition，EMT)是進入血管、淋巴管轉(zhuǎn)移的首要步驟。誘導(dǎo)EMT的細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子有Snail、Twist、TGF-β、Tiam1等。其中，TGF-β是EMT最主要的誘導(dǎo)因子之一。與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系最為密切。
　　 近年來，血小板與腫瘤進展的關(guān)系引人注目。血小板表面蛋白激活受體(Pr

2、oteinase-activatedreceptor，PAR-1)活化后可激活α顆粒，在腫瘤進展過程中有著非常重要的意義。但目前尚不清楚血小板PAR1激活是否誘導(dǎo)結(jié)直腸癌EMT。
　　 目的:探討血小板蛋白酶激活受體-1激活在結(jié)腸癌細胞SW620細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用并探討其機制。
　　 方法:
　　 1.用梯度濃度(0μM，1μM，3μM，5μM，7μM，9μM，10μM)的血小板PAR1激動劑(TFLLR

3、-NH2)處理SW620細胞，用MTT法檢測SW620細胞的增殖情況。用梯度濃度(0μM，1μM，3μM，5μM，7μM，9μM)的血小板PAR1激動劑（TFLLR-H2）激活血小板，用流式細胞學(xué)技術(shù)檢測血小板表面的CD62P來判斷血小板的活化程度。
　　 2.實驗分組:①未激活血小板懸液100μL+SW620細胞（實驗對照組）②激活血小板懸液100μL+SW620細胞（實驗對照組）③激活血小板上清100μL+SW620細胞（實

4、驗組）④TGF-β12μL+SW620細胞（陽性對照組）⑤TFLLR-NH20.04μL+SW620細胞（單純激動劑組）⑥培養(yǎng)基100μL+SW620細胞（陰性對照組）。按照實驗分組，24孔板培養(yǎng)24小時后PathScan(R)EMTDuplexIFKit染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察SW620細胞E-cadherin、Vimentin表達情況。
　　 3.實驗分組:①未激活血小板懸液400μL+SW620細胞（實驗對照組）②激活

5、血小板懸液400μL+SW620細胞（實驗對照組）③激活血小板上清400μL+SW620細胞（實驗組）④TGF-β120μL+SW620細胞（陽性對照）⑤TFLLR-NH20.4μL+SW620細胞（單純激動劑組）⑥培養(yǎng)基400μL+SW620細胞（陰性對照）。按照實驗分組，6孔板培養(yǎng)24小時后westernblot檢測SW620細胞E-ca曲erin、Vimentin、Smad4的表達。
　　 4.ELISA法（酶聯(lián)免疫吸附實

6、驗法）檢測梯度濃度(0μM，1μM，3μM，5μM，7μM，9μM)的PAR1激動劑(TFLLR-NH2)激活血小板后TGF-β1釋放量。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT實驗:各個不同濃度(1μM，3μM，5μM，7μM，9μμM，10μM)PAR1激動劑激活后492nm下測得OD值各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。流式細胞學(xué):各濃度(1μM，3μM，5μM，7μM，9μM)PAR1激動劑處理組CD62P陽性率分別

7、為（43.52±1.5）％，(64.22±3.60)％，（54.46±1.82）％，（53.15±2.7）％，（54.63±3.66）％均較對照組(0μM組)(14.35±0.86)％升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.免疫熒光結(jié)果:TGF-β1和PAR1激活的血小板及上清均能下調(diào)E-cadherin表達，上調(diào)Vimentin表達，未激活的血小板與SW620細胞共培養(yǎng)24小時，能夠下調(diào)E-cadherin表達，

8、上調(diào)Vimentin表達。TFLLR-NH2對SW620細胞E-cadherin和Vimentin的表達無影響。
　　 3.westernblot結(jié)果:TGF-β1和PAR1激活的血小板及上清均能下調(diào)E-cadherin表達，上調(diào)Vimentin表達，未激活的血小板與SW620細胞共培養(yǎng)24小時，能夠上調(diào)E-cadherin表達，下調(diào)Vimentin表達。TFLLR-NH2對SW620細胞E-cadherin和Vimentin的

9、表達無影響。各個處理組與陰性對照組相比，Smad4表達無明顯變化。
　　 4.ELISA實驗:梯度濃度(1μM，3μM，5μM，7μM，9μM)PAR1激動劑激活血小板后，其上清液中測得TGF-β1含量分別為0.095±0.003，0.133±0.005，0.322±0.007，0.497±0.012，0.571±0.012，0.592±0.021。各組TGF-β1含量均較對照組（0μM組）升高，其差異有統(tǒng)計學(xué)意(P＜0.05)

10、，而7μM，9μM組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.低劑量(≤10μM)的PAR1激動劑(TFLLR-NH2)對人結(jié)腸癌細胞SW620的生長增殖及EMT的發(fā)生無影響。但可以激活血小板表面的PAR1受體，使血小板活化。
　　 2.血小板表面的PAR1激活后能夠促進人結(jié)腸癌細胞SW620發(fā)生EMT，這一過程可能是通過TGF-β/Non-Smad實現(xiàn)的。
　　 3.血小板PAR1激活