基于表面等離子體共振原理的病原體快速檢測(cè)芯片的研制.pdf

1、目的：構(gòu)建基于表面等離子體共振(SurfacePlasmonResonance，SPR)原理的病原體快速檢測(cè)基因芯片。利用SPR傳感器的快速、敏感、高效、不需標(biāo)記及純化等特點(diǎn)，建立一套完整的基因芯片系統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)，使之具有設(shè)備簡(jiǎn)單，靈敏度高，應(yīng)用范圍廣，技術(shù)穩(wěn)定易于掌握等優(yōu)點(diǎn)，達(dá)到使基因芯片的檢測(cè)技術(shù)能更適用于臨床、普通實(shí)驗(yàn)室甚至更復(fù)雜環(huán)境的目的。 方法：1.通過(guò)查閱文獻(xiàn)報(bào)道以及臨床調(diào)查，確定檢測(cè)靶病原體。對(duì)各靶病原體的特征性核酸

2、標(biāo)志進(jìn)行確定以及擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)并對(duì)擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化確定；2.設(shè)計(jì)各靶病原體特異性寡核苷酸探針，利用生物信息學(xué)方法對(duì)探針進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬篩選；3.在載玻片表面鋪制具有SPR響應(yīng)的50nm金膜層，并比較了常用兩種不同直徑膠體金溶液金膜鋪制方法的效果；4.利用硫醇化合物表面單分子自組裝層技術(shù)(Self-assembledMonolayer，SAM)固定探針，制備具有SPR響應(yīng)的基因檢測(cè)芯片，并對(duì)自組裝時(shí)間，探針濃度等進(jìn)行優(yōu)化；5.將篩選出的檢測(cè)

3、探針、陽(yáng)性對(duì)照探針以及陰性探針點(diǎn)利用SAM技術(shù)制成雜交芯片，利用酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光法對(duì)各探針的雜交性能進(jìn)行檢測(cè)；6.利用SPR檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)所構(gòu)建芯片的檢測(cè)性能進(jìn)行了測(cè)試；7.結(jié)合Chelex-100處理臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，與常規(guī)臨床檢測(cè)方法比較該芯片的檢測(cè)特性。 結(jié)果：1.確定了7種臨床常見(jiàn)的感染病原體及臨床少見(jiàn)但重要的病原體為檢測(cè)目標(biāo)，包括：淋病奈瑟氏菌，人類(lèi)乳頭瘤病毒(HPV)，金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿

4、菌、洛菲氏不動(dòng)桿菌。并完成各靶病原體特征性核酸標(biāo)志的確定以及擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)并對(duì)擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化確定；2.設(shè)計(jì)各靶病原體特異性寡核苷酸探針，利用生物信息學(xué)方法對(duì)探針進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬篩選，各探針的G+C含量、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、自身二聚體以及重復(fù)堿基數(shù)等指標(biāo)均符合寡核苷酸探針設(shè)計(jì)要求，所選用探針特異性強(qiáng)，雜交溫度均＜65℃；3.在載玻片表面鋪制具有SPR響應(yīng)的50nm金膜層：確定Frens法(檸檬酸鈉還原法)膠體金溶液配制，以及膠體金納米粒子自組裝單層

5、膜為催化模板，氯金酸/羥胺金膜鍍制法金膜鋪制方法。通過(guò)比較確定使用2.5nm膠體金法鋪制金膜；4.利用硫醇化合物表面單分子自組裝層技術(shù)(SAM)固定探針，制備具有SPR響應(yīng)的基因檢測(cè)芯片，并確定自組裝時(shí)間為4.5小時(shí)，探針濃度為：1500nmol/L；5.酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)顯示，相應(yīng)檢測(cè)探針點(diǎn)及陽(yáng)性對(duì)照均有雜交結(jié)果，陰性對(duì)照、空白對(duì)照和其他探針點(diǎn)均無(wú)顯影結(jié)果，背景清晰，結(jié)果可靠。證明所設(shè)計(jì)的探針準(zhǔn)確可靠，可用于各靶序列的檢測(cè)；6.實(shí)驗(yàn)

6、結(jié)果顯示，將芯片利用SPR檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)，其最低檢測(cè)值可達(dá)10fmol/L，同目前常用的熒光素cy3為報(bào)告分子的方法相比，其靈敏度要高出500倍。雜交時(shí)間在16小時(shí)可獲得滿意的雜交效果。特異性檢測(cè)顯示該芯片特異性強(qiáng)，與更改堿基的探針無(wú)雜交；7.臨床樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性探針點(diǎn)及陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)均有顯影結(jié)果，陰性對(duì)照、空白對(duì)照和其他探針點(diǎn)均無(wú)顯影結(jié)果，結(jié)果可靠。檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)經(jīng)典檢測(cè)鑒定方法結(jié)果一致，證明本檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠，可用于臨床樣品的檢測(cè)。

7、 結(jié)論：基因芯片技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，具有快速、敏感、高效、高通量等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸應(yīng)用于DNA測(cè)序、基因表達(dá)譜分析、基因多態(tài)性分析、藥物開(kāi)發(fā)、基因診斷等多個(gè)領(lǐng)域。目前通用的基因芯片技術(shù)有多種，但都存在著靈敏度不高，檢測(cè)技術(shù)復(fù)雜，條件和設(shè)備要求高等問(wèn)題，限制了該技術(shù)在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)自行研究構(gòu)建了基于表面等離子體共振(SPR)原理的病原體快速檢測(cè)基因芯片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該芯片檢測(cè)技術(shù)靈敏度高，特異性