反向遺傳致弱的基因Ⅶ型NDV生物學特性及免疫效力研究.pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起多種禽類的傳染病，該病傳播速度快，引起高死亡率，是嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要一類疫病。NDV屬于禽副粘病毒血清1型(APMV-1)，按照NDV F基因序列的差別可以將NDV分為至少16個基因型。各基因型毒株毒力有所差別，同時各基因型NDV之間具有抗原差異。當前中國普遍使用的ND疫苗株多是基因Ⅰ型和Ⅱ型病毒株，但基因Ⅶ型

2、NDV為中國雞群廣泛流行強毒株，流行株和疫苗株之間存在抗原差異性，因此造成與流行毒株具有不同基因型的ND疫苗不能提供有效保護和阻止排毒。F蛋白是NDV重要的表面保護性抗原，介導NDV包膜與質(zhì)膜之間的相互融合等作用;L蛋白參與NDV基因組的轉(zhuǎn)錄與復制。本研究利用基因工程技術先后對基因Ⅶ型NDV強毒株的F和L基因進行突變，再利用NDV反向遺傳技術拯救獲得基因Ⅶ型NDV MG7株。接著對MG7株的生物學特性進行研究，鑒定MG7株的免疫原性，評

3、價其對SPF雞的保護效率，為NDV基因Ⅷ型反向遺傳疫苗提供科學數(shù)據(jù)，為ND的防控及ND新型疫苗的研究提供理論依據(jù)。
　　1.基因Ⅶ型NDV減毒株MG7的構建及其生物學特性鑒定
　　以動物病毒分子生態(tài)學創(chuàng)新團隊已經(jīng)構建成功的基因Ⅶ型NDV強毒G7株的全基因組cDNA和輔助表達質(zhì)粒為基礎，通過Overlap方法將G7株的F蛋白裂解位點(112RRQKRF117)突變成NDV弱毒株F蛋白的裂解位點(112GRQGRL117)，同時

4、將L蛋白第Ⅵ結(jié)構域中第1954位氨基酸由谷氨酸(E)突變成谷氨酰胺(Q)，成功構建NDV突變株MG7的全長cDNA質(zhì)粒pBSK-MG7并拯救出突變的基因Ⅶ型NDV MG7株，對拯救獲得的MG7株與親本強毒G7株在毒力、遺傳穩(wěn)定性和生長特性等生物學活性進行鑒定。結(jié)果顯示:MG7株(MDT＞120h;ICPI=0.20;IVPI=0)與親本G7株的毒力相比明顯減弱;MG7株病毒在雞胚上傳至15代時，突變位點能夠穩(wěn)定遺傳;弱毒MG7株在BHK

5、-21F細胞上的生長曲線與親本G7株相似。結(jié)果表明，成功拯救出基因Ⅶ型NDV MG7株，MG7株具有NDV弱毒株的生物學特性。
　　2.基因Ⅶ型NDV減毒株MG7免疫SPF雞的效果研究
　　以成功拯救的基因Ⅶ型NDV減毒MG7株和商品化弱毒LaSota株作為疫苗，通過免疫SPF雞評價其免疫效果。通過滴鼻點眼接種4周齡SPF雞后，檢測血清中NDV特異性抗體滴度、血清中IFN-γ含量、雞外周血淋巴細胞中CD4+和CD8+T細胞亞

6、群變化以及淋巴細胞增殖反應;采用NDV基因Ⅶ型強毒G7株攻擊免疫后的雞，測定其免疫保護效率。結(jié)果顯示:MG7株免疫3周后，能夠誘導SPF雞血清中產(chǎn)生NDV特異性抗體，且抗體水平(＞26.08)高于LaSota株免疫組(252)。MG7株免疫1～3周內(nèi)，外周血淋巴細胞(PBMCs)中CD8α+T淋巴細胞亞群比例呈逐漸上升趨勢;MG7株免疫后第3周，PBMCs中CD4+T淋巴細胞亞群的比例明顯增加(p＜0.05）;MG7株免疫后PBMCs在

7、體外增殖活性明顯增強，第2周增強最大(p＜0.01）;同時，MG7株免疫組的血清中IFN-γ含量也呈遞增趨勢，與空白對照組存在極顯著差異(p＜0.01)。此外，以基因Ⅶ型NDV強毒株進行攻毒試驗，在攻毒后第2～6d，MG7株免疫組SPF雞未檢測出排毒;LaSota株免疫組檢測到不同程度排毒現(xiàn)象，而空白對照組全部死亡。結(jié)果表明，與LaSota株免疫組相比，MG7株能夠有效誘導雞產(chǎn)生較高的體液免疫應答和細胞免疫應答，提高SPF雞的保護效率和