Rpf蛋白結構域的生物學及免疫學特性的初步研究.pdf

1、結核?。═uberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）所致的以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病，也是現今全世界范圍內最重要的致病和致死因素之一。據WHO估計，目前全世界約有1/3人口處于MTB感染狀態(tài)，我國TB患者數量居世界第二位，感染人數已達4億。這部分人中只有10％可能最終發(fā)展成為活動性TB，而絕大多數為隱性感染，感染的細菌以休眠菌的形式存在。這種休眠菌耐藥性極強，可在體內

2、長期存在，常規(guī)方法難于分離培養(yǎng)?？ń槊纾˙acilleCalmette-Guerin，BCG）是MTB的減毒株，是目前唯一用于TB預防的疫苗，但其對隱性感染者無效，還存在保護期短，免疫應答較弱等缺陷。因此，研究MTB的致病及免疫機制，研制更為有效的診斷、治療和預防MTB感染，特別是針對隱性感染的新方法、新措施及新疫苗等具有重要意義。
　　近年來研究發(fā)現，在MTB休眠菌的復蘇過程中，MTB分泌的5種促進復活因子（Resuscitat

3、ion promoting factor，Rpf）起了重要作用，分別為Rv0867c（RpfA），Rv1009（RpfB），Rv1884c（RpfC），Rv2389c（RpfD）和Rv2450c（RpfE）。Rpf最早在藤黃微球菌（Micrococcusluteus，M.luteus）中發(fā)現。通過同源性分析發(fā)現，Rpf存在于多種富含G+C的革蘭陽性細菌中，其基因編碼的蛋白均具有Rpf樣結構域。在研究中發(fā)現，Rpf蛋白的結構域與完整Rpf

4、蛋白具有一致的生物學特性。對Rpf家族的研究還發(fā)現，Rpf樣蛋白不僅與細菌的增殖有關，還可能是宿主免疫系統(tǒng)識別的靶抗原。
　　在本研究中，我們分別克隆、表達和純化了藤黃微球菌Rpf蛋白、Rpf結構域蛋白、RpfB結構域蛋白；制備了抗藤黃微球菌Rpf結構域和抗RpfB結構域的單克隆抗體（monoclonalantibody，Mab）；研究了藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域蛋白的生物學功能和免疫學特性。評價其用于MTB分

5、離培養(yǎng)添加劑、相關抗原檢測方法建立及TB新型疫苗研制的可能性。
　　實驗目的：利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達并純化藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域蛋白；制備抗藤黃微球菌Rpf結構域、抗RpfB結構域的Mab；進一步研究其生物學功能和免疫學特性。
　　實驗方法和結果：
　　1．藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域的克隆、表達與純化
　　采用PCR方法分別從藤黃微球菌和MTBH37Rv的基因組中分別

6、擴增出相應大小的藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域目的基因片段，并分別克隆入pUC-19載體中測序，結果與GenBank報道的完全一致。將目的基因分別克隆人pProEXHTb表達載體中，酶切鑒定后，分別在E.coli中由IPTG誘導表達目的蛋白。經SDS-PAGE分析，表達的3種目的蛋白與預期分子量一致；Western-blot分析表明3種融合6×His的目的蛋白均可與抗6×HisMAb特異反應。3種目的蛋白均以包涵體的形式

7、表達，用親和色譜法在變性條件下分別純化3種目的蛋白。
　　2．藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域的生物學功能研究
　　2.1抗藤黃微球菌Rpf結構域、抗RpfB結構域Mab的制備及鑒定
　　用藤黃微球菌Rpf結構域蛋白分別免疫BALB/c小鼠，進行細胞融合，獲得了3株能穩(wěn)定分泌抗藤黃微球菌Rpf結構域Mab的雜交瘤細胞系，分別命名為F3D10、G10D5、G6C8，其中F3D10、G10D5為IgG1亞類，

8、G6C8為IgM亞類，其相對親和力為F3D10>G6C8>G10D5；用RpfB結構域蛋白免疫BALB/c小鼠，進行細胞融合，獲得了3株能穩(wěn)定分泌抗RpfB結構域Mab的雜交瘤細胞系，分別命名為D3A5、B8G11、A9C8，其中D3A5、B8G11為IgG1亞類，A9C8為IgM亞類，其相對親和力為A9C8>D3A5>B8G11。
　　分別構建了pcDNA3.1(-)-Rpf結構域及pcDNA3.1(-)-RpfB結構域真核表達

9、載體，轉染COS-7細胞，用間接免疫熒光法檢測表明藤黃微球菌Rpf結構域蛋白和RpfB結構域蛋白在COS-7細胞中有表達，也間接驗證了Mab的特異性。
　　2.2抗藤黃微球菌Rpf結構域及抗RpfB結構域Mab的交叉實驗。
　　分別用藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域、RpfB結構域、RpfA（本實驗室純化的MTBRpfA蛋白,質粒為國外MikeYoung教授饋贈）及H37Ra作為抗原與制備的兩種Mab反應，結果顯示：兩種抗結構

10、域Mab均可以與以上蛋白和H37Ra菌株發(fā)生反應。
　　2.3藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域蛋白促藤黃微球菌及MTBH37Ra休眠菌的復蘇和生長作用
　　取藤黃微球菌和MTBH37Ra的休眠菌適當稀釋后，隨機分為3組。每組分別加入不同稀釋濃度的純化蛋白及相應的抗結構域Mab，取不同時間點的培養(yǎng)液測OD600值，繪制生長曲線。結果顯示：當藤黃微球菌Rpf和Rpf結構域濃度均為100pmol/L時，刺激藤黃微球菌

11、復蘇和生長作用明顯，當藤黃微球菌Rpf濃度為10pmol/L、Rpf結構域濃度為100pmol/L時，刺激MTBH37Ra復蘇和生長作用明顯，而且這種刺激作用在加入了1:600的抗藤黃微球菌Rpf結構域Mab后明顯被抑制；當RpfB結構域濃度為1000pmol/L時，刺激藤黃微球菌復蘇和生長作用明顯，當RpfB結構域濃度為500pmol/L時，刺激MTBH37Ra復蘇和生長作用明顯，而且這種刺激作用在加入了1:1000的抗RpfB結構域

12、Mab后明顯被抑制。
　　3.藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域的免疫學特性研究
　　采用皮下包埋的方法，分別將藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域蛋白滴到硝酸纖維素膜小塊上，免疫小鼠3次，每次間隔2周，同時設BCG免疫組和生理鹽水對照組。用ELISA方法檢測免疫小鼠血清中的特異性抗體平均滴度。結果顯示：藤黃微球菌Rpf蛋白免疫組最高抗體效價為1:12800，藤黃微球菌Rpf結構域蛋白免疫組最高抗體效價

13、為1:4800，RpfB結構域蛋白免疫組最高抗體效價為1:6400。
　　為了檢測蛋白免疫小鼠引起的細胞免疫應答，最后一次免疫完成兩周后，分離各免疫組小鼠脾淋巴細胞，在體外經PPD刺激后，MTT法檢測淋巴細胞增殖反應，藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域蛋白免疫小鼠后的刺激指數分別為：2.86±0.12，2.10±0.09，2.40±0.11，明顯高于生理鹽水對照組(0.90±0.21)（P<0.01）,但不及BCG免疫

14、組(3.50±0.23)（P<0.05）。藤黃微球菌Rpf蛋白誘導產生的IFN-γ，IL-10和IL-12平均水平分別為1528±36ng/L,485±13ng/L和302±14ng/L；藤黃微球菌Rpf結構域蛋白誘導產生的IFN-γ，IL-10和IL-12平均水平分別為1126±36ng/L，368±13ng/L和289±14ng/L；RpfB結構域蛋白誘導產生的IFN-γ，IL-10和IL-12平均水平分別為1432±30ng/L，

15、503±11ng/L和311±11ng/L；BCG免疫組誘導產生的IFN-γ，IL-10和IL-12平均水平分別為2022±38ng/L，578±13ng/L和400±10ng/L；生理鹽水對照組IFN-γ，IL-10和IL-12水平分別為256±6ng/L，76±3ng/L和56±4ng/L。從結果可以看出，3種蛋白免疫小鼠后誘導產生的細胞因子水平明顯高于生理鹽水對照組(p<0.01)，但不及BCG免疫組(p<0.05)。
　　

16、免疫完成后第四周，用105CFUMTBH37Rv毒株經尾靜脈攻擊上述各免疫組小鼠，計數脾臟細菌負荷數。與生理鹽水對照組相比，藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域蛋白免疫組小鼠對H37Rv毒株攻擊后MTB在脾臟中的增殖均有顯著抑制作用（差值分別為1.89log10、1.61log10和1.78log10）(p<0.05)，但不如BCG免疫組（差值為2.83log10）(p<0.05)。
　　結論：藤黃微球菌Rpf、Rpf結