溴化乙錠誘導(dǎo)無(wú)線粒體DNA乳腺癌T47D細(xì)胞系的建立及其細(xì)胞生物學(xué)特征和超微結(jié)構(gòu)的改變.pdf

1、　　本實(shí)驗(yàn)利用低劑量EtBr(50ng/ml)抑制mtDNA復(fù)制的方法，嘗試篩選并建立一株不含mtDNA的乳腺癌T47Dρ0細(xì)胞系，并探討它在生長(zhǎng)特征、細(xì)胞周期、早期凋亡和超微結(jié)構(gòu)等方面與對(duì)照T47D細(xì)胞的差別。研究主要分為如下兩大部分：　　第一部分：采用經(jīng)典的低劑量EtBr抑制mtDNA復(fù)制的方法，在補(bǔ)充外源性的尿嘧啶和丙酮酸鈉的條件下，經(jīng)約32天的特殊培養(yǎng)后，分離并篩選無(wú)mtDNA的人乳腺癌T47Dρ0細(xì)胞。并經(jīng)過(guò)DotBlot、

2、real-timePCR和選擇性培養(yǎng)基等方法反復(fù)鑒定后，確認(rèn)該細(xì)胞株內(nèi)mtDNA缺失并具有ρ0細(xì)胞共有的營(yíng)養(yǎng)依賴型體外生長(zhǎng)特性。該細(xì)胞能在含尿嘧啶、丙酮酸鈉和15％的Gibco胎牛血清環(huán)境中連續(xù)傳代、穩(wěn)定生長(zhǎng)。　　第二部分：采用顯微鏡形態(tài)學(xué)、MTT法繪制生長(zhǎng)曲線、體外克隆形成實(shí)驗(yàn)和PI細(xì)胞周期等實(shí)驗(yàn)對(duì)T47Dρ0細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)T47Dρ0細(xì)胞較對(duì)照組T47D細(xì)胞的形態(tài)略小、皺縮，分裂相少，生長(zhǎng)繁殖能力更緩慢，G0-

3、G1期細(xì)胞比例上升、S期細(xì)胞的比例下降，出現(xiàn)G1-S期阻滯現(xiàn)象。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)(AnnexinV和rhodamine123)分析mtDNA缺失和細(xì)胞凋亡的關(guān)系，結(jié)果顯示檢測(cè)雖然T47Dρ0細(xì)胞的線粒體跨膜電位較正常有明顯的下降，但mtDNA缺失并不能大幅度引起細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生。透視電鏡檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)，T47Dρ0細(xì)胞的線粒體超微結(jié)構(gòu)有明顯變化，主要表現(xiàn)為正常嵴及內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)部分或大范圍的溶解，線粒體自身的腫脹或髓磷體樣改變以及基質(zhì)的電子