頭孢曲松鈉通過上調(diào)GLT-1發(fā)揮抗全腦缺血引起的海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的作用.pdf

1、目的：研究表明，膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體亞型-1(glialglutamate transporter-1，GLT-1)在維持細(xì)胞外液谷氨酸濃度處于正常水平，從而防止其興奮性毒性作用方面發(fā)揮重要作用。例如，在大腦中動(dòng)脈閉塞局灶性腦缺血模型中，應(yīng)用GLT-1反義寡核苷酸可使梗死灶的范圍擴(kuò)大。本室最近研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠腦缺血耐受模型中，腦缺血預(yù)處理通過上調(diào)海馬CA1區(qū)GLT-1的表達(dá)發(fā)揮對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的保護(hù)作用。這些結(jié)果提示，增強(qiáng)GLT-1

2、的表達(dá)和功能有可能發(fā)揮腦保護(hù)作用，調(diào)制GLT-1有可能成為腦缺血疾病治療的新位點(diǎn)。 2005年Rothstein等報(bào)道，β-內(nèi)酰胺類抗生素頭孢曲松鈉(Ceflriaxone，CTX)可以特異性地增強(qiáng)GLT-1的表達(dá)和對(duì)谷氨酸的攝取。隨后，韓國(guó)學(xué)者Chu于2007年報(bào)道CTX能通過上調(diào)GLT-1的表達(dá)縮小大腦中動(dòng)脈閉塞性腦梗塞的梗死灶范圍。這些發(fā)現(xiàn)為研究CTX的抗腦缺血作用提供了有力的線索和依據(jù)。但CTX是否對(duì)全腦缺血造成的神經(jīng)元

3、損傷具有保護(hù)作用尚未見研究報(bào)道。 因此，本實(shí)驗(yàn)觀察β-內(nèi)酰胺類抗生素CTX對(duì)大鼠四血管閉塞全腦缺血所致海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的影響，并應(yīng)用免疫組化和Western blot等方法檢測(cè)大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1表達(dá)的變化，為闡明CTX通過上調(diào)GLT-1的表達(dá)而發(fā)揮抗神經(jīng)元缺血性損傷提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床上腦血管疾病的防治研究提供新的線索和依據(jù)。方法：將100只預(yù)先凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈的雄性Wistar大鼠(270-320 g

4、)隨機(jī)分為6組： sham組(n=15)：行全腦缺血的sham手術(shù)，即只暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不阻斷血流。于sham手術(shù)后1 d、3 d取材觀察GLT-1表達(dá)變化，7 d取材觀察海馬CAl區(qū)錐體神經(jīng)元遲發(fā)性死亡(DND)情況(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只動(dòng)物)。 CTX對(duì)照組(n=15)：于sham術(shù)前5 d開始連續(xù)腹腔注射CTX(200 mg/kg)，每日一次，共5次；其它同sham組。 全腦缺血組(n=15)：全腦缺血8 mi

5、n后恢復(fù)血液再灌流，其它同sham組。 CTX預(yù)防組(n=35)：于全腦缺血前5 d開始連續(xù)腹腔注射CTX，每天一次，共5次。根據(jù)CTX的劑量，進(jìn)一步分為50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg 3個(gè)亞組。各組均于全腦缺血再灌注后7 d取材觀察海馬CAl區(qū)錐體神經(jīng)元DND情況(每個(gè)亞組5只動(dòng)物)；50 mg/kg亞組和200 mg/kg亞組于全腦缺血術(shù)后1 d、3 d取材觀察GLT-1表達(dá)的變化。 CTX

6、治療組(n=15)：全腦缺血8 min后恢復(fù)血液再灌流，于全腦缺血當(dāng)天開始連續(xù)腹腔注射CTX 5 d，每天一次，共5次。根據(jù)CTX的劑量進(jìn)一步分為50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg 3個(gè)亞組(每個(gè)亞組5只動(dòng)物)，于全腦缺血再灌注后7 d取材觀察海馬CAl區(qū)錐體神經(jīng)元DND情況。 CTX預(yù)防+治療組(n=5)：于全腦缺血前5 d開始，至全腦缺血后5 d，連續(xù)腹腔注射CTX(200 mg/kg)，每天一次，共1

7、0次；于全腦缺血再灌注后7 d取材觀察海馬CAl區(qū)錐體神經(jīng)元DND情況。 結(jié)果： 1.CTX減輕全腦缺血引起的海馬CAl區(qū)錐體神經(jīng)元DND硫堇染色結(jié)果顯示，sham組大鼠海馬CAl區(qū)無錐體細(xì)胞缺失。CTX(200 mg/kg)對(duì)照組大鼠海馬CAl區(qū)組織形態(tài)與sham組基本一致。全腦缺血組大鼠海馬CAl區(qū)DND明顯，HG顯著升高，ND顯著下降(P＜0.05)。CTX預(yù)防組中，50 mg/kg劑量組海馬CAl區(qū)組織形態(tài)與全腦

8、缺血組基本一致；100 mg/kg劑量組海馬CAl區(qū)可見少量神經(jīng)元死亡；200 mg/kg劑量組海馬CAl區(qū)DND不明顯，與全腦缺血組相比，HG明顯降低，ND明顯升高(P＜0.05)，表明大劑量的CTX有效地預(yù)防了全腦缺血引起的海馬CAl區(qū)錐體神經(jīng)元的DND。CTX治療組(50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg)，海馬CAl區(qū)出現(xiàn)明顯的DND，表明全腦缺血后應(yīng)用CTX不能減輕全腦缺血打擊引起的海馬CAl區(qū)錐體神經(jīng)元DN

9、D。而CTX(200 mg/kg)預(yù)防+治療組海馬CAl區(qū)DND不明顯，與全腦缺血組相比，HG顯著降低，ND顯著升高(P＜0.05)。 2.CTX上調(diào)全腦缺血大鼠海馬CAl區(qū)GLT-1蛋白的表達(dá)GLT-1免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，sham組大鼠海馬CAl區(qū)于sham術(shù)后1 d、3 d均可見到一定量GLT-1陽性顆粒，其染色較淺。CTX(200 mg&g)對(duì)照組于sham術(shù)后1 d、3 d可見大量GLT-1陽性顆粒廣泛分布于海馬CAl

10、區(qū)，與sham組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，其積分光密度、平均光密度和陽性染色面積均顯著升高(P＜0.05)。全腦缺血組，特別是全腦缺血3 d組在錐體細(xì)胞層及其周圍可見大片的GLT-1表達(dá)缺失區(qū)域。低劑量CTX(50 mg/kg)預(yù)防組于全腦缺血后1 d、3d與sham組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，大鼠海馬CAl區(qū)GLT-1表達(dá)均無明顯變化。而大劑量CTX(200 mg/kg)預(yù)防組于全腦缺血后1 d、3 d可見大量GLT-1陽性顆粒廣泛分布于海馬CA1區(qū)

11、，尤其在海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元細(xì)胞層可見大量、深染的GLT-1陽性顆粒包繞錐體神經(jīng)元，與sham組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，其積分光密度、平均光密度和陽性染色面積均顯著升高(P＜0.05)。 Western blot分析發(fā)現(xiàn)，末次手術(shù)或處理后1 d，sham組大鼠可見海馬CAl區(qū)GLT-1蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)。CTX(200 mg/kg)對(duì)照組與sham組相比，GLT-1表達(dá)明顯上調(diào)，表現(xiàn)為GLT-1與β-actin IOD比值的升高(P＜0.05)

12、。與sham組相比，全腦缺血組及小劑量CTX(50 mg/kg)預(yù)防組GLT-1的表達(dá)無明顯變化，而大劑量CTX(200 mg/kg)預(yù)防組GLT-1表達(dá)明顯上調(diào)，表現(xiàn)為GLT-1與β-actin IOD的比值顯著升高(P＜0.05)。末次手術(shù)或處理后3 d，各組GLT-1的表達(dá)與1 d時(shí)各對(duì)應(yīng)組相類似。 結(jié)論： 1預(yù)防性給予GLT-1的特異性激動(dòng)劑CTX減輕了大鼠全腦缺血引起的海馬CAl區(qū)錐體神經(jīng)元的DND。