人胃癌多藥耐藥細(xì)胞系BGC823-5-FU耐藥機制的初步研究.pdf

1、胃癌(gastric cancer)是常見的惡性腫瘤之一。該病發(fā)病隱匿，早期不易被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)出現(xiàn)臨床癥狀時大部分已處于進展期，化療在進展期胃癌的治療中占有重要地位。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)及其衍生物是臨床上常用的治療進展期胃癌的化療藥物，通過抑制胸苷酸合酶發(fā)揮作用。然而在臨床上應(yīng)用5-FU一段時間后胃癌細(xì)胞會對其敏感性降低，同時對其它種類的胃癌化療藥物也產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，即多藥耐藥(Multidrug-

2、resistance，MDR)。因此研究5-FU誘導(dǎo)的耐藥機制為逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞的多藥耐藥提供理論依據(jù)。在體外建立多藥耐藥細(xì)胞系是研究MDR的重要手段。鑒于目前國內(nèi)外尚缺乏5-FU誘導(dǎo)的人胃癌BGC823細(xì)胞多藥耐藥模型，本文在前期建立的5-FU誘導(dǎo)的多藥耐藥細(xì)胞株BGC823/5-FU的基礎(chǔ)上，從經(jīng)典耐藥途徑P-gp、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和Survivin方面對該細(xì)胞株的耐藥機制進行了初步研究，為尋找逆轉(zhuǎn)

3、胃癌多藥耐藥的新方法提供了理論依據(jù)。 蛋白質(zhì)組學(xué)作為后基因組學(xué)時代研究的一個重要內(nèi)容，已廣泛深入到生命科學(xué)和醫(yī)藥學(xué)的各個領(lǐng)域，其理論和技術(shù)的發(fā)展完善為腫瘤多藥耐藥研究帶來了新的思維方式，它可以從蛋白質(zhì)整體水平這一全新角度來研究腫瘤細(xì)胞多藥耐藥機制，有助于發(fā)掘出新的多藥耐藥相關(guān)分子。本實驗運用固相pH梯度雙向電泳技術(shù)成功構(gòu)建了胃癌細(xì)胞BGC823和5-FU誘導(dǎo)的多藥耐藥細(xì)胞BGC823/5-FU的雙向電泳圖譜，并比較了兩者之間的差

4、異，以期發(fā)現(xiàn)新的與胃癌多藥耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì)分子，為進一步研究胃癌多藥耐藥機制奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容和主要結(jié)果如下： 一、人胃癌多藥耐藥細(xì)胞系BGC823/5-FU耐藥機制的初步研究前期研究中，我們采用反復(fù)大劑量沖擊結(jié)合逐步遞增藥物濃度法建立了國人低分化胃腺癌耐藥細(xì)胞株BGC823/5-FU。本研究應(yīng)用熒光倒置顯微鏡觀察BGC823/5-FU的形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BGC823/5-FU細(xì)胞較BGC823細(xì)胞胞體略增大，胞核增大，形狀更為

5、不規(guī)則，并可見散在的多核瘤巨細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測BGC823/5-FU細(xì)胞表面P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的表達和細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素濃度，結(jié)果表明，BGC823/5-FU細(xì)胞P-gp的表達較其親本細(xì)胞BGC823顯著上升，細(xì)胞蓄積DNR的能力卻明顯下降；應(yīng)用RT-PCR法檢測細(xì)胞mdrl的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BGC823/5-FU細(xì)胞mdrl的表達較BGC823升高。以上結(jié)果表明，P-gp參與了BGC823/5-FU細(xì)胞多

6、藥耐藥的產(chǎn)生。 運用Western-blot法檢測了凋亡相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BGC823/5-FU細(xì)胞Bax和Caspase-3的表達較BGC823細(xì)胞顯著下調(diào)，Bel-2和Survivin的表達明顯上調(diào)。這些結(jié)果表明，Survivin、Bel-2、Bax和Caspase-3參與了胃癌細(xì)胞BGC823/5-FU多藥耐藥性的形成，對這些分子的研究有助于揭示胃癌細(xì)胞多藥耐藥的機制，可為研發(fā)與這些基因或蛋白相關(guān)的藥物提供依據(jù)。

7、 二、胃癌細(xì)胞及其多藥耐藥細(xì)胞蛋白質(zhì)分子的差異展示化學(xué)裂解方法提取胃癌細(xì)胞BGC823和5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞BGC823/5-Fu總蛋白質(zhì)，Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，運用固相pH梯度雙向凝膠電泳技術(shù)成功構(gòu)建了胃癌細(xì)胞BGC823和5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞BGC823/5-FU的雙向電泳圖譜，ImagingMaster 2D Melanie 5.0圖像分析軟件進行比較分析，識別差異表達的蛋白質(zhì)。 結(jié)果顯示，在胃

8、癌細(xì)胞BGC823凝膠圖譜上可識別(1282±36)個蛋白點，在耐藥細(xì)胞BGC823/5-FU凝膠圖譜上可識別(1305±29)個蛋白點。其中27個點僅在耐藥細(xì)胞中高表達，但在敏感細(xì)胞中未出現(xiàn)，5個蛋白點僅在敏感細(xì)胞中高表達，但在耐藥細(xì)胞中未出現(xiàn)。耐藥細(xì)胞蛋白質(zhì)表達量為敏感細(xì)胞2-5倍的蛋白點為33個，敏感細(xì)胞蛋白表達量為耐藥細(xì)胞2-5倍的蛋白點為17個。結(jié)果表明，雙向電泳可以有效分離、展示胃癌細(xì)胞BGC823及其5-氟尿嘧啶耐藥細(xì)胞B